1. 蛋白質質譜分析具體流程
質譜技術在蛋白質組學中的應用
王海龍楊靜祁振國岳秀蘭
(包頭醫學院生物化學與分子生物學教研室，內蒙古包頭014010；赤峰市第一醫院』)
中圖分類號(}so3 文獻標識碼A 文章編號1006—740X(2006)02—0231一o3
蛋白質組學是後基因組時代的一個新領域，它通
過在蛋白質水平上對細胞或機體基因表達的整體蛋白
質的定量研究，來揭示生命的過程和解釋基因表達控
制的機理⋯ 。蛋白質組學分為表達蛋白質組學(Ex·
pression Proteomies)和細胞圖譜蛋白質組學(Cell Map
Pmteomies)，前者指細胞和組織表達的蛋白質的定量
圖譜，它依賴二維凝膠電泳圖譜和圖像分析，它能在整
體蛋白質水平上研究細胞的通路，以及疾病、葯物和其
它生物刺激所引起的紊亂，因此它可能發現疾病標志
和闡明生物通路；後者是指通過純化細胞器或蛋白質
復合物，用質譜鑒定蛋白質組分，確定蛋白質和蛋白質
相互作用的亞細胞位置 】。9O年代以來隨著人類基
因組計劃的實施，引發了生物信息學(Bioinformaties)
的發展，使蛋白質分析發生了革命性的變化。現在將
高分辨2一維電泳、高靈敏度的生物質譜和快速增長
的蛋白質和DNA資料庫三者結合起來，為高通量的蛋
白質組學(High throughout Proteomies)鋪平了道路 。
這里主要介紹質譜技術在蛋白質組學中的應用。
收稿日期：2006-03-02
作者簡介：王海龍(1951一)，男。大學，副教授。
l 質譜技術的發展歷史
1．1 質譜的開發歷史要追溯到2O世紀初，Thomson
創制的拋物線質譜裝置，1919年Aston製成了第一台
速度聚焦型質譜儀，成為了質譜發展史上的里程碑。
最初的質譜儀主要用來測定元素或同位素的原子量，
隨著離子光學理論的發展，質譜儀不斷改進，其應用范
圍也在不斷擴大，到2O世紀5O年代後期已廣泛地應
用於無機化合物和有機化合物的測定。現今質譜分析
的足跡已遍布各個學科的技術領域，在固體物理、冶
金、電子、航天、原子能、地球和宇宙化學、生物化學及
生命科學等領域均有著廣闊的應用。質譜技術在生命
科學領域的應用更為質譜的發展注入了新的活力，形
成了獨特的生物質譜技術。
1．2 基本原理質譜(Mass Spectrometry)是帶電原
子、分子或分子碎片按質量的大小順序排列的圖像。
質譜儀是一類能使物質離化成離子並通過適當的電
場、磁場將它們按空間位置、時間先後或者軌道穩定與
否實現質量比分離，並檢測強度後進行物質分析的儀
器。質譜儀主要由分析系統、電學系統和真空系統組
成 。
用於分析的樣品分子在離子源中離化成具有不同
質量的單電荷分子和碎片離子，這些單電荷離子在加
1 J 1 J 1"J 1掩J
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232 包頭醫學院學報 第22卷
速電場中獲得相同動能並形成一束離子，進入由電場
和磁場組成的分析器，離子束中速度較慢的離子通過
電場後偏轉大，速度快的偏轉小；在磁場中離子發生角
速度矢量相反的偏轉，即速度慢的離子依然偏轉大，速
度快的偏轉小；當兩個場的偏轉作用彼此補償時，它們
的軌道便相交於一點。與此同時，在磁場中還能發生
質量的分離，這樣就使具有同一質量比而速度不同的
離子聚焦在同一點上，不同質量比的離子聚焦在不同
的點上，其焦面接近於平面，在此處用檢測系統進行檢
測即可得到不同質量比的譜線，即質譜。通過質譜分
析，我們可以獲得分析樣品的分子量、分子式、分子中
同位素構成和分子結構等多方面的信息 J。
2 質譜技術種類
2．1 電噴霧質譜技術(Electrospray ionization Mass
Spectrometry，ESI—MS) 是在毛細管的出口處施加一
高電壓，所產生的高電場使從毛細管流出的液體霧化
成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發，液滴表面的電荷強
度逐漸增大，最後液滴崩解為大量帶一個或多個電荷
的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進
入氣相⋯ 。電噴霧離子化的特點是產生高電荷離子
而不是碎片離子，使質量電荷比降低到多數質量分析
儀器都可以檢測的范圍，因而大大擴展了分子量的分
析范圍，離子的真實分子質量也可以根據質荷比及電
荷數算出。電噴霧質譜的優勢就是它可以方便地與多
種分離技術聯合使用 j。
2．2 基質輔助激光解吸附質譜技術(Matrix Assisted
Laser Desorption／Ionization，MALDI) 基本原理是將
分析物分散在基質分子中並形成晶體，當用激光照射
晶體時由於基質分子經輻射所吸收的能量，導致能量
蓄積並迅速產熱，從而使基質晶體升華，致使基質和分
析物膨脹並進入氣相。MALDI所產生的質譜圖多為
單電荷離子，因而質譜圖中的離子與多肽和蛋白質的
質量有一一對應關系。MALDI產生的離子常用飛行
時間檢測器來檢測，理論上講，只要飛行管的長度足
夠，檢測器可檢測分子的質量數是沒有上限的，因此質
譜很合適對蛋白質、多肽、核酸和多糖等大分子的研
究。
2．3 快原子轟擊質譜技術(Fast Atom Bomebardment
Mass Spectrometry，FABMS) 一種軟電離技術，是用快
速隋性原子射擊存在於底物中的樣品，使樣品離子濺
出進入分析器，這種軟電離技術適於極性強、熱不穩定
的化合物的分析，特別適於多肽和蛋白質的分析研究。
FABMS只能提供有關離子的精確質量，從而可以確定
樣品的元素組成和分子式。而FABMS—MS串聯技術
的應用可以提供樣品較為詳細的分子結構信息，從而
使其在生物醫學分析中迅速發展起來 ]。
2．4 同位素質譜技術是一種開發和應用比較早的
技術，被廣泛地應用於各個領域，但它在醫學領域的應
用只是近近幾年的事。由於某些病原菌具有分解特定
化合物的能力，該化合物又易於用同位素標示，人們就
想到用同位素質譜的方法檢測其代謝物中同位素的含
量以達到檢測該病原菌的目的，同時也為同位素質譜
在醫學領域的應用開辟了一條思路。
3 電泳分離後凝膠上蛋白質的質譜鑒定
電泳分離後凝膠上的蛋白質，先用適當的蛋白內
切酶酶切成肽段，再用質譜鑒定。現有四種制樣方法：
3．1 凝膠內酶切凝膠內酶切的靈敏度高，是當前廣
泛採用的樣品制備方法。最常用的蛋白內切酶是胰蛋
白酶。它在蛋白質主鏈精氨酸和賴氨酸的C一端進行
切割。文獻中有多種凝膠內酶切的方法，這里介紹改
進後的Wilm的方法。
將電泳後凝膠上的蛋白質斑點以最小的體積切
下，並將凝膠塊切成約lmm 小顆粒，轉入小離心管
內，加入約5O 的lOOmmol／L碳酸氫銨溶液洗膠粒
5min，棄去碳酸氫銨液，加入50pJ乙腈使凝膠脫水1O
一15min。若膠粒未完全脫水再用乙腈脫水～次，棄去
乙腈液。將離心管置入真空離心蒸發濃縮器內，微加
熱15rain使膠粒完全乾燥。將50pJ新鮮配製的
10mmoVL DTY韻100mmol／L碳酸氫銨溶液加入離心
管內，使膠粒水化。在56℃加熱30rain還原樣品，棄
去DTr溶液，加入乙腈放置15min，再在Speed Vac微
加熱乾燥15rain，加入5O l 55mmol／L碘乙醯胺的
100mmol／L碳酸氫銨溶液，烷基化半胱氨酸殘基上的
巰基。室溫暗室中放置20 min，棄去上清夜，加入
50pJ乙腈放置15min，在Speed Vac內乾燥。加入2O l
胰蛋白酶溶液在4℃放置45—60min使膠粒再水化，
加入1O一2o 碳酸氫銨溶液覆蓋膠粒，37cI=保溫1小
時後，放置過夜，所得溶液供質譜分析用。
3．2 電洗脫後在溶液中酶解 電洗脫是電泳後從凝
膠上回收蛋白質的經典方法。通常蛋白質量多於0．
O01 mmol。將含SDS的凝膠與MALDI TOF MS分析結
合，可分析亞mmol的蛋白質。Schuh macher等用無
SDS pH2．5的乙酸銨作洗脫緩沖液，電洗脫系統的極
性相反，蛋白質SDS復合物在原位解離，游離的蛋白
質遷移至陰極，用標准蛋白樣品實驗，回收率達25％
～ 56％ [引
。
3．3 膜上酶切膜上酶切的方法已不常用於質譜分
析，因為它的靈敏度低於凝膠內酶切。電轉移時不是
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第2期 王海龍，等．質譜技術在蛋白質組學中的應用 233
所有的蛋白質都能有效轉移，而且在印跡過程中蛋白
質可能丟失。另外從PVDF膜上提取酶切後多肽時效
率不高，提取時加Triton 100可以增加多肽的提取效
率，但去污劑干擾質譜鑒定 J。
3．4 印跡過程中酶切 1999年Bins等報道將固定有
胰蛋白酶的膜，置於凝膠和PVDF膜之間在印跡過程
中使蛋白質樣品發生酶切，為了蛋白質完全酶切，印跡
過程需要特殊設計。印跡後的膜用基體溶液浸透後可
用MALDI TOF MS直接分析。該法的主要特點是印跡
過程中平行進行酶切，其靈敏度不如標准方法 J。
4 用肽質量指紋譜鑒定蛋白質
蛋白質組學中最有意義的突破是用生物質譜鑒定
電泳後凝膠上的蛋白質。質譜技術已取代了生物化學
中經典的Edman降解技術¨。。，這是由於質譜技術能
進行高通量的分析，能分析蛋白質混合物，而且靈敏。
肽質量指紋譜方法最初由Henzel及其同事提
出¨ ，很快成為高通量蛋白質鑒定的選用方法。分析
時用MALDI TOF MS測定凝膠內酶切後多肽混合物的
質量，獲得肽質量指紋圖譜。蛋白質酶切後生成多肽
混合物，可以在蛋白質序列資料庫內進行理論預測，並
對質譜實測多肽混合物與理論預測的數據進行比較，
質譜實測到足夠肽段的質量與資料庫中一個蛋白質理
論預測肽段質量匹配，蛋白質可明確鑒定_1 。
隨著科學技術的進步，質譜也得到了快速發展，特
別是與生物技術的結合，開創了質譜應用的新領域。
質譜已成為生命科學研究中非常重要的工具。其研究
成果也將大大推動人類基因組的研究，並將使人類對
生命的本質，其發生發展過程的認識達到一個前所未
有新高度。
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2. 蛋白質組學數據分析筆記說明
之前本來打算根據自己對蛋白質組學數據分析的經驗和理解寫一系列相關教程出來供復習參考，沒想到在網上查到別人已經做過了，而且筆記相當全面，從樣本處理到質譜儀原理再到數據分析等等都有提及，雖然是2016-2017年的課程，但內容並未過時，對我自己也大有益處。雖然其中一些內容有重復，但我也不想再進行整理了。因為筆記鏈接只有微信稿，擔心後期會失效，所以這里只是簡單地拷貝過來，以供復習之用。
1. 蛋白質組學研究方法概述（上）
1. 蛋白質組學研究方法概述（下）
2. 蛋白質組學樣品前處理（1）
2. 蛋白質組學樣品前處理（2）
2. 蛋白質組學樣品前處理（3）
2. 蛋白質組學樣品前處理（4）
3. 蛋白質譜的原理及使用（1）
3. 蛋白質譜的原理及使用（2）
3. 蛋白質譜的原理及使用（3）
3. 蛋白質譜的原理及使用（4）
4. 蛋白質組學數據分析基礎（1）
4. 蛋白質組學數據分析基礎（2）
4. 蛋白質組學數據分析基礎（3）
庫鑫
博士，2007年畢業於華中科技大學同濟醫學院，獲學士學位。同年9月被保送至中科院上海葯物研究所並於2010年取得碩士學位。2010年10月至2014年6月在德國慕尼黑工業大學（Technische Universität München）生物分析與蛋白質組學研究所（Prof. Bernhard Kuster）攻讀博士學位，專業方向為基於串聯質譜的蛋白質組學在腫瘤葯物研究中的應用。庫鑫在博士期間發展了基於定量質譜的化學蛋白組學方法用於近生理條件下激酶小分子葯物脫靶效應的研究，相關結果發表於J Prot Res, J Prot等雜志上。現任職於上海交通大學系統生物醫學研究院，研究方向：腫瘤相關生物標志物的發現和蛋白質糖基化修飾的研究。
劉曉慧
博士，高級工程師，復旦大學化學系/生物醫學研究院 。 蛋白質組學與系統生物學實驗室，2003年畢業於湖南師范大學 獲理學學士學位，2006年畢業於湖南師范大學 獲生物化學與分子生物學碩士學位，2014年畢業於復旦大學，獲化學生物學博士學位。2006年至今，工作於復旦大學化學系，從事基於生物質譜的蛋白質和多肽定量方法的應用和開發，熟悉iTRAQ,MRM,MRM-HR,SWATH等相關技術，參與發表相關論文30餘篇。
李溱
博士，副教授。中國農業大學生物學院，植物生理學與生物化學國家重點實驗室，中國農業大學「985」功能基因組中心生物質譜實驗室。李博士1999年畢業於北京師范大學，獲得理學學士學位，2007年畢業於美國德克薩斯州Texas A&M大學，獲得博士學位。2008年-2009年在University of Illinois at Urbana-Champaign從事博士後研究，2011年至今，就職於中國農業大學生物學院，負責生物質譜實驗室日常運行，對外提供蛋白質組學和代謝組學技術服務，開展基於高分辨質譜技術的植物代謝組學和蛋白質組學研究工作。
廖日晶
博士，副研究員。2006.9-2011.7於中科院上海有機化學研究所碩博連讀，研究方向為天然產物抗生素的生物合成機制，2011.8-2015.5於諾華（中國）生物醫學研究所從事博士後研究，研究方向為運用生物質譜技術開發組蛋白後修飾的新型分析方法學。2015年6月至今任中科院上海臨床研究中心副研究員，從事生物質譜技術在基礎以及臨床科研方面的運用和開發新型分析方法學的研究。在攻讀博士與博士後期間，以第一作者身份在美國化學會志（JACS IF: 13.0）、分析化學（Analytical Chemistry IF: 5.9）、化學和生物學（Chemistry & Biology IF: 6.6)等重要刊物上發表多篇論文。
沈誠頻
博士，2005年畢業於復旦大學化學系，獲得理學學士學位；同年保送至復旦大學生物醫學研究院攻讀博士學位，師從復旦大學生物醫學研究院常務副院長楊芃原教授，2011年獲得理學博士學位，攻讀博士學位期間，作為訪問學者於2009年-2011年前往美國麻省理工大學生物工程系交流學習。主要開展的工作包括：人肝蛋白質組學，蛋白質組學信息學，糖蛋白質組學。於2011年作為應用科學家加盟康昱盛信息科技有限公司生物信息學部，並於2013年聘為公司高級應用科學家及生物信息學部主管，主要負責蛋白質組學及生物通路分析軟體和方法的技術支持及方案咨詢。
唐家澍
博士，2006年畢業於南京大學理科強化部，生物化學專業，獲得學士學位。2013年畢業於中科院上海生化所，師從曾嶸研究員，主要從事蛋白質組學技術和應用研究。隨後在中科院上海生科院系統生物學重點實驗室進行了為期兩年的博士後訓練，主要從事系統生物學和基於分子生物學的功能研究。從2016年1月開始，在賽默飛世爾科技色譜質譜事業部擔任應用工程師，主要擅長磷酸化蛋白質組學技術，定量蛋白質組學技術以及質譜數據的生物統計學和生物信息學分析。
吳澤明
賽默飛質譜代謝組學業務發展經理，2012年畢業於中科院大連化物所，同年加入Thermo,先後任Chemist、Application Scientist與北區技術負責人等職。近10年來一直從事和密切介入基於質譜技術的代謝組學、脂質組學相關研究，在PNAS、MOL BIOSYST等雜志發表論文多篇。現專注致力於質譜與各種分離技術在Metabolomics/Lipidomics及其在疾病、生物功能與食品組學等方向的應用方法開發、技術支持和科學項目合作。
張偉
博士，賽默飛轉化醫學業務發展經理，在Chem. Comm., Anal. Chem., J. Proteome Res., Proteomics, J.Proteomics等知名雜志上發表論文14篇，其中第一作者10篇。2012年畢業於復旦大學生物醫學研究院，獲博士學位；2012年加入賽默飛公司，從事生物質譜與蛋白質組學領域的研究、技術開發、市場開拓工作。
周岳
畢業於中國科學院生物物理研究所，致力於蛋白質組學，生物制葯的應用開發，技術支持和科學研究工作。在生物質譜蛋白定性分析，翻譯後修飾以及蛋白定量方面有豐富的經驗，參與完成多篇高水平文章的質譜工作。在賽默飛世爾科技擔任質譜應用工程師期間，優化了QE系列產品，fusion系列產品在蛋白質組學應用中的質譜參數，並在Orbitrap用戶中進行推廣。建立了基於QE,Fusion的DIA數據採集以及數據分析流程，實現了7500個蛋白的DIA定量分析。
3. 蛋白質組學數據搜庫及FDR的控制
蛋白質組學中，各種軟體對質譜得到的譜圖進行搜庫時通常是利用以下三種方法之一進行：
2.實驗和計算得到的譜圖的自相關性（最先應用於SEQUEST）；
3.計算觀測到的理論碎片質量和實際碎片質量之間匹配上的數目來自於偶然的概率（Mascot中率先使用）。
針對Andromeda肽段搜索引擎做些介紹：
嵌入到MaxQuant中Andromeda肽段搜索引擎就是基於二項式分布概率對肽段-譜圖進行打分的，同時利用該得分進行後續的分析，如：對肽段進行排序、確定肽段修飾的可能性；standalone Andromeda可以處理少量的譜圖，每張譜圖經處理後都可以得到對應的有得分的肽段列表和蛋白列表，沒有嚴格的FDR的控制。
Andromeda的優勢展現在：1.確定同一肽段的多種修飾；2.解析混合譜圖。
結合Proteome Discoverer 2.2中應用的演算法，對一些細節進行解釋。