① 瓊脂糖凝膠的配製
稱量、溶膠、倒膠、拔梳。
配置步驟如下:
1、稱量,小膠板0.8%的膠需要瓊脂粉0.104gTBE13mL。
2、熔膠,將所稱量的瓊脂粉與TBE在錐形瓶中混合,在微波爐內反復加熱2到3次至瓊脂粉溶解並無氣泡。
3、倒膠,干凈的膠槽內擺好梳子,往膠內滴加1uL左右核酸染料,混勻,待冷卻至不燙手,輕輕倒入膠板內。
4、拔梳待大約2分鍾即可。
② SDS-PAGE凝膠制實驗及其各實驗試劑的配製方法
SDS-PAGE凝膠制備屬於實驗室最常規的操作了,剛開始做蛋白實驗總是在找凝膠配製實驗中所用試劑的配方,這里總結了分離膠、濃縮膠、分離膠和濃縮膠緩沖液、考馬斯亮藍染液、樣品緩沖液、電泳緩沖液等配方。
1.
分離膠(12%)
配製
所需試劑
所需體積
分離膠(12%)
30%丙烯醯胺
6.0
ml
1.5
mol/l
Tris-HCl
3.8
ml
10%SDS
150
μl
10%過硫酸銨
150
μl
TEMED
6
μl
蒸餾水
4.9
ml
2.
濃縮膠(5%)
配製
所需試劑
所需體積
濃縮膠(5%)
30%丙烯醯胺
1.3
ml
1.5
mol/l
Tris-HCl
1.0
ml
10%SDS
80
μl
10%過硫酸銨
80
μl
TEMED
8
μl
蒸餾水
5.5
ml
3.
分離膠緩沖液(pH8.9)
配製
所需試劑
所需體積
分離膠緩沖液
Tris
36.6
g
1
mol/l
HCl
48
ml
蒸餾水
補足至100
ml
4.
濃縮膠緩沖液(pH6.7)
配製
所需試劑
所需體積
濃縮膠緩沖液(pH6.7)
Tris
5.98
g
1
mol/l
HCl
48
ml
蒸餾水
補足至100
ml
5.
30%丙烯醯胺(pH≤7.0)
配製
所需試劑
所需體積
30%丙烯醯胺(pH≤7.0)
丙烯醯胺
29
g
甲叉-雙丙烯醯胺
1
g
蒸餾水
補足至100
ml
6.
10%過硫酸銨(W/V):1g過硫酸銨溶於10ml水中,4℃保存數周,盡量現用現配。
7.
10%SDS:將10
g
SDS溶於80ml重蒸水中並輕緩攪拌(室溫低時需水浴加熱溶解),再定容至100ml,室溫存放。
8.
樣品緩沖液
配製
所需試劑
所需體積
樣品緩沖液
1
M
Tris-HCl(pH6.7)
5
ml
SDS
2.5
g
巰基乙醇
1
ml
溴酚蘭
0.05
g
蔗糖
10
g
蒸餾水
補足至100ml
9.
考馬斯亮藍染色液:0.25g考馬斯亮藍R-250用少量甲醇溶解後,用甲醇(40ml)-乙酸(10ml)水溶液稀釋至100ml。
10.
Tris-甘氨酸電泳緩沖液(pH8.3)
配製
所需試劑
所需體積
Tris-甘氨酸
電泳緩沖液(pH8.3)
Tris鹼
15.1
g
甘氨酸
94
g
10%(W/V)SDS
50
ml
去離子水
補足至100
ml
凝膠配製所需試劑的母液不能放置太久,有條件的實驗室可將母液保存在4度冰箱中,放置母液被微生物污染或者出現沉澱。