A. 按照國標GB21311-2007做硝基呋喃代謝物檢測，在摸質譜條件MRM的時候怎麼檢測不到目標離子對啊
能否提問的更詳細些？
四個離子對是指硝基呋喃的代謝物AOZ，AMOZ，SEM，AHD5么？
怎麼不對？是找不到離子對做SRM，還是質量數不對上？
可能有幾個原因，比如Q1Q3的解析度設置，也有可能液相分離不好，也有可能內標沒做好。。。
霧水中
B. 硝基呋喃類代謝物標准物質濃度
濃度是0.04/M mol•L，呋喃西林的代謝物 氨基脲(SEM)是硝基呋喃類(Nitrofurans,本文中簡式NFs)葯物中呋喃西林的代謝物。
C. 半揮發性有機化合物 (semivolatile organic compounds)的測定
半揮發性有機化合物系指可在有機溶劑中分配，同時可進行氣相色譜分析的一大類化合物。按照萃取條件的不同還可將這一大類有機物區分為鹼-中性可萃取有機物和酸性可萃取有機物，包括有機氯農葯、多氯聯苯、有機磷農葯、多環芳烴類、氯苯類、硝基苯類、硝基甲苯類、鄰苯二甲酸酯類、亞硝基胺類、苯胺類和氯代苯胺類、鹵代烴類、鹵代醚類、聯苯胺類、氯代聯苯胺類、呋喃類、苯酚類、氯代酚類和硝基酚類等。在工農業生產發展的同時，這類有機污染物在環境樣品中廣泛存在。
氣相色譜-質譜法 (GC-MS)
方法提要
分別在鹼性和酸性條件下，以二氯甲烷萃取水和廢水中的半揮發性有機化合物，被濃縮後的有機溶液可直接進行 GC-MS 分析，或者經過進一步凈化，再以 GC-MS 檢測。
方法的檢出限見表82.20 (隨儀器和操作條件而變) ，適用於飲用水、地表水、地下水、海水和工業廢水等的監測。
表82.20 鹼-中性、酸性可萃取有機物
續表
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儀器和裝置
氣相色譜-質譜儀，EI 源，帶分流 (不分流) 進樣口。
自動進樣器，樣品瓶 1.5mL。
旋轉蒸發器或 KD 濃縮器。
10μL 微量注射器。
2L 分液漏斗。
300mL 具塞三角燒瓶。
300mL 具塞茄型燒瓶 (旋轉蒸發器用) 。
試劑
凈化水 用正己烷洗滌過的蒸餾水或純凈水。
氯化鈉 優級純，在 350℃下加熱 6h，除去表面吸附的有機化合物，冷卻後保存於干凈的試劑瓶中。
無水硫酸鈉 優級純，在 400℃下加熱 6h，除去表面吸附的有機化合物，冷卻後保存於干凈的試劑瓶中。
氫氧化鈉 優級純，配置成 10mol/L 水溶液。
二氯甲烷 殘留農葯分析純。
正己烷 殘留農葯分析純。
丙酮 殘留農葯分析純。
硫酸 優級純。
標准儲備溶液 (濃度為 1000mg/L) 准確稱取 0.0100g 的標准純品 (純度在 96% 以上) ，溶解在丙酮或者其他合適的有機溶劑中，之後定容至 10mL 容量瓶中 (或者購置商品標准儲備溶液) 。將標准儲備溶液轉移至帶聚四氟乙烯密封墊的螺旋蓋樣品瓶中，在- 10℃ 以下的溫度下避光保存。
內標和替代物溶液 (1000μg/mL) 推薦的內標和回收率指標物 (表82.21) ，稱取化合物 0.0100g，溶於少量二硫化碳中，轉移至 10mL 容量瓶中並用丙酮稀釋至刻度，最終溶液中的二硫化碳體積濃度約為 20%。除苝-d12外，大多數化合物可溶解於少量的甲醇、丙酮或甲苯中。-10℃ 以下避光保存。使用時將該溶液用丙酮稀釋至 100μg/mL，每1000mL 水樣中加入 1mL 此溶液，樣品中每種替代物的濃度為 100μg / L。
GC-MS 校準溶液為 50μg / mL 十氟三苯基膦 (DFTPP) 的二氯甲烷溶液。
表82.21 推薦的內標和替代物
樣品採集與保存
樣品必須採集在玻璃瓶中。自采樣後到萃取時，所有樣品必須在 4℃冷藏，水樣充滿樣品瓶。如果有餘氯存在，每 1000mL 樣品中需要加入 80mg 硫代硫酸鈉。所有樣品必須在7d內完成萃取，萃取液在40d內完成分析。
分析步驟
1)萃取。將1L水樣加入到2L分液漏斗中，加入1.00mL替代物標准溶液，混合均勻。用廣泛pH試紙檢查試樣pH值，加入氫氧化鈉溶液調節pH值大於11，樣品瓶中加入60mL二氯甲烷，振搖30s沖洗瓶壁，之後轉移至分液漏斗中。振動分液漏斗5min並周期性放氣釋放壓力，靜置10min，使有機相分層。如果乳化現象嚴重，需要採用機械手段完成兩相分離，包括攪動、離心、用玻璃棉過濾等方法破乳(也可採用冷凍的方法破乳)。將二氯甲烷相收集在300mL三角燒瓶中，水相中再加入60mL二氯甲烷，重復上述液液萃取過程，將二氯甲烷相合並到300mL三角燒瓶中。以同樣的方法重復第三次萃取，將合並的萃取物標明為鹼-中性組分。用(1+1)H2SO4將水相pH值調至小於2，分別用60mL二氯甲烷萃取酸化的水相三次，合並二氯甲烷相，萃取物標明為酸性組分。
全部二氯甲烷相中加入少量無水硫酸鈉，放置25min乾燥，將二氯甲烷過濾至300mL茄形瓶中，用旋轉蒸發器濃縮至2mL(也可用K-D濃縮器完成濃縮過程)，轉移至10mL試管中，用N2吹脫至約1mL或更少，分析前加入適當的內標溶液，使其最終濃度為1μg/mL，用二氯甲烷定容至1mL，進行GC-MS分析。
在實際樣品分析過程中，根據測定目標物不同，有時需要對上述萃取溶液進行凈化處理(如表82.22所示)之後，再進行GC-MS分析。
表82.22 目標分析物及凈化方法
2)標准曲線。用標准儲備液配製至少5個不同濃度的校準曲線用標准溶液，每一濃度的標准溶液中加入已知量的一種或多種內標，其中有一個標准溶液濃度接近但高於方法檢出限(MDL)，其餘濃度應當對應實際樣品中目標物的濃度。
3)GC-MS分析條件。色譜柱:DB-5或同等石英毛細管色譜柱，柱長30m，內徑0.25mm或0.32mm，液膜厚度1μm。色譜分離條件:柱溫40℃(4min)→10℃/min→270℃，保持直至苯並［ghi］苝流出。
載氣(氦氣)流速為30cm/s，無分流進樣，進樣時間2min，進樣量1～2μL。
定性分析為全掃描方式，質量范圍為35～500u，掃描時間1s/次。
定量分析為選擇離子檢測(SIM)，各化合物選擇離子質量數(包括定量離子和參考離子)如表82.20所示，內標和回收率指示物的選擇離子質量數如表82.21所示。
4)GC-MS系統性能測試。每天分析運行開始時，都必須以DFTPP檢查GC-MS系統是否達到性能指標要求。性能測試要求儀器參數為:電子能量70eV，質量范圍35～450u，掃描時間為每個峰至少有5次掃描，但每次掃描不超過1s。得到背景校正的DFTPP質譜後，確認所有關鍵質量數是否都達到表82.23的要求。
表82.23 DFTPP關鍵離子和離子豐度指標
定性及定量分析
1) 定性分析。本方法中測定的各化合物的定性鑒定是根據保留時間和扣除背景後的樣品質譜圖與參考質譜圖中的特徵離子比較完成的。參考質譜圖中的特徵離子被定義為最大相對強度的三個離子，或者任何相對強度超過 30%的離子。
2) 定量方法。定量方法為內標法，標准曲線為至少 5 點校正，內標濃度為 1μg / mL。在 SIM 檢測方式下，以標准系列中各目標化合物峰面積與內標峰面積的比對目標化合物的濃度作圖，得到該目標化合物的定量校準曲線。校準曲線的線性回歸系數至少為0.9990。樣品溶液在與標准溶液相同的分析條件下測定，根據樣品溶液中目標物與內標物的峰面積比，由定量校準曲線得到該化合物的濃度。水樣中該化合物的濃度計算如下:
岩石礦物分析第四分冊資源與環境調查分析技術
方法性能指標
將標准樣品加入到 1L 純水中，使得每種目標物的濃度為 100μg/L，與試樣分析步驟相同，在試樣預處理之後進行 GC-MS 測定。計算 4 次結果的平均回收 (單位為 μg/L)和回收結果的標准偏差 (s，單位為 μg/L) ，表82.24 為方法的精密度和准確度，可作為實驗室質量控制的指標，用來判斷實際樣品分析的可靠性。
表82.24 方法的精密度和准確度
續表
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注: D 為檢測出，檢測結果 >0。
D. 硝基呋喃的檢測
硝基呋喃類原型葯在生物體內代謝迅速，無法檢測。但其代謝產物因和蛋白質結合而保證長時間穩定存在。所以一般以硝基呋喃類葯物代謝物為目標分析物的檢測，來達到檢測硝基呋喃類葯物殘留量的目的。 在檢測前一般需要對樣品進行處理，一般分為洗滌、水解和衍生化及凈化等處理步驟，下面以國家標准檢測方法（GB/T20752-2006）和行業標准方法（SN/T 1627-2005）為例介紹一下檢測前處理的一般步驟。
洗滌
GB/T20752-2006：2g均質好的樣品，15ml的甲醇-水（2+1），混勻1min，4000rmp離心，棄掉上清液。
SN/T 1627-2005：1g組織，不用洗滌。
水解和衍生化
GB/T20752-2006：加入20ml 0.2M鹽酸，加入0.3ml的衍生化試劑（75mg 2-硝基苯甲醛溶於10ml二甲基亞碸，0.05M），37℃避光振盪16h。
SN/T 1627-2005：加入30ml 0.125M鹽酸，加入1ml的衍生化試劑（100mg 2-硝基苯甲醛溶於12.5ml二甲基亞碸），37℃避光振盪16h。
凈化
GB/T20752-2006：加入5ml 0.1M的磷酸氫二鉀，並用1M氫氧化鈉調pH到7.4，離心上清液過HLB柱，5ml乙酸乙酯洗脫，40 ℃ 吹乾，定容到1ml（10ml乙腈+0.3ml，用水定容到100ml）
SN/T 1627-2005：加入4ml 1M的氫氧化鈉，並用1M鹽酸和0.1M氫氧化鈉調pH到7-7.5，3000rmp離心10min，上清液倒入250ml的分液漏斗中，殘渣用5ml水洗， 3000rmp離心10min，上清液也倒入250ml的分液漏斗中，加乙酸乙酯40ml，振搖1ml，靜置3min，重復提取1次，合並乙酸乙酯，通過裝無水硫酸鈉的漏斗過濾至雞心瓶中，50 ℃ 旋蒸至3-5ml，再轉移到試管中， 50 ℃ 吹乾，定容至1ml（0.1%乙酸：乙腈：甲醇 3：3：2）。 經過對樣品檢測前的處理後，就可以對樣品中的硝基呋喃類葯物代謝物殘留量進行檢測，有關豬肉、禽肉、水產品中硝基呋喃類葯物代謝殘留量測定的方法，國家有相應的檢測標准，也有相關的行業標准，另外文獻報道也有一些檢測方法。國家和行業標准檢測方法基本是液相色譜法或液相色譜-串聯質譜法，區別在於提取溶液和凈化方法上有差異，以及外標法或內標法定量的不同，檢出限大多為0.5ug/kg。文獻報道有固相萃取液相色譜-質譜法和液相色譜-串聯質譜組合法，其中前者與國家、行業標准檢測方法的檢出限相同，後者檢出限能達到0.03 ug/kg。
已公開的各類硝基呋喃類葯物代謝物質殘留的檢測方法 編號 方法名稱 方法簡單介紹 1 豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法 樣品中殘留的硝基呋喃類代謝物在酸性條件下用2-硝基苯甲醛衍生化，正己烷脫脂，用HLB柱凈化，點噴霧離子化，液相色譜-串聯質譜檢測，外標法或同位素內標法定量 2 動物源食品中硝基呋喃類葯物代謝物殘留量檢測方法
高效液相色譜/串聯質譜法 樣品中殘留的硝基呋喃類代謝物在酸性條件下用2-硝基苯甲醛衍生化，乙酸乙酯提取，正己烷脫脂凈化，點噴霧離子化，液相色譜-串聯質譜檢測，同位素內標法定量。 3 動物源食品中硝基呋喃類葯物代謝物殘留量的測定
高效液相色譜-串聯質譜法 樣品依次用甲醇、乙醇、乙醚洗滌，在酸性條件下用2-硝基苯甲醛衍生化，乙酸乙酯提取，電噴霧離子化，液相色譜-串聯質譜檢測，同位素內標法定量。 4 進出口動物源食品中硝基呋喃類代謝物殘留量測定方法
高效液相色譜串聯質譜法 樣品中殘留的硝基呋喃類代謝物在酸性條件下用2-硝基苯甲醛衍生化，乙酸乙酯提取，氯化鈉溶液反萃取凈化，電噴霧離子化，液相色譜-串聯質譜檢測，同位素內標法定量。 5 水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定
液相色譜-串聯質譜法 樣品中殘留的的硝基呋喃類代謝物在酸性條件下用2-硝基苯甲醛衍生化，乙酸乙酯提取，電噴霧離子化，液相色譜-串聯質譜檢測，同位素內標法定量。 6 水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定
高效液相色譜法 樣品中殘留的硝基呋喃類代謝物用三氯乙酸-甲醇溶液提取，經鄰氯苯甲醛衍生化，乙酸乙酯提取，固相萃取柱凈化，電噴霧離子化，液相色譜-串聯質譜檢測，外標法定量。 7 固相萃取高效液相色譜-質譜法測定動物組織中硝基呋喃代謝產物 樣品中殘留的硝基呋喃類代謝物在酸性條件下用2-硝基苯甲醛或2-氯苯甲醛衍生化，固相萃取柱凈化，電噴霧離子化，液相色譜-質譜檢測，同位素內標法定量。 8 液相色譜/串聯質譜線性組合法測定動物組織中硝基呋喃類代謝產物 樣品中殘留的硝基呋喃類代謝物在酸性條件下用2-硝基苯甲醛衍生化，乙酸乙酯提取，氯化鈉溶液洗滌，自製凈化試劑凈化，電噴霧離子化，液相色譜-串聯質譜檢測，同位素內標法定量。 除表格中介紹的檢測方法用於豬肉、禽肉、動物性水產品中外，高效液相色譜或高效液相色譜-串聯質譜法還可以用於測定奶粉 、蜂王漿 、飼料 中硝基呋喃類葯物的含量。
E. 阿司匹林的含量測定
阿司匹林含量測定綜述 08葯學1班：冉賢飛
阿司匹林片為常用的解熱、鎮痛葯，收載於(中國葯典2000年版)二部。原含量測定方法為酸、鹼中和滴定法。目前市場上流通的解熱、鎮痛葯物中，含阿司匹林或以阿司匹林為主葯的較多。除了中國葯典的原含量測定方法以外，針對各個劑型有多種含量測定的方法。如採用高效液相法測定其含量，可消除其他含有酸、鹼的物質對其測定的干擾，可更有效的控制制劑的質量。方法操作簡便，專一性強，結果准確。也有用數學模型進行計算的如近紅外漫反射技術，其原理是根據標樣集中樣品的近紅外光譜運用化學計量學方法建立光譜特徵值(如吸光度)與待測成分之間的數學關系(簡稱數學模型)
1．阿司匹林及阿司匹林制劑的含量測定
阿司匹林及阿司匹林制劑的含量測定有多種方法，其中包括葯典所載的酸、鹼中和滴定法
及紫外分光光度法，高效液相法等。
1．1阿司匹林酸鹼滴定法：
直接滴定：方法：取本品0。4g，精密稱定，加中性乙醇20ml，溶解，加酚酞指示液3d，用氫氧化鈉滴定液（0.1mol/l）滴定。每1ml滴定液相當於18。02mg 的C9H8O4
水解後剩餘滴定：方法：取本品1.5g，精密稱定加氫氧化鈉滴定液（0.5mol/l）50.0ml，混合，緩緩煮沸10min，放冷，加酚酞指示液，用硫酸滴定液（0.25mol/l）滴定剩餘的氫氧化鈉。
兩步滴定法：取本品10片，精密稱定，研細，精密稱取片粉適量（約相當於阿司匹林），加中性乙醇20ml,振搖使阿司匹林溶解，加酚酞指示液3d，滴加氫氧化鈉滴定液（0.1mol/l）至溶液顯粉紅色。加定量過量的氫氧化鈉滴定液（0.1mol/l）40ml，置水浴上加熱15min並時時振搖，迅速放冷至室溫，用硫酸滴定液（0.05mol/l）滴定剩餘的鹼。根據消耗的滴定液體積及滴定度計算含量
1．2阿司匹林制劑的電極法測定
儀器與試劑：電極電位和溶液酸度測試均使用pHs—loC型數字式酸度離子計；參比電極為232型飽和甘汞電極；試劑均為分析純，實驗用水為去離子水經高錳酸鉀處理後蒸餾而得。
電極制備：將載體物質三苄基錫辛酸酯20mgl聚氯乙烯（PVC）0．33g和增塑劑鄰硝基苯基辛醚o．65g溶解於四氫呋喃（THF）3g中，攪拌澄清後將其傾倒於40 mm×40 mm的水平玻璃板上。待THF揮發完後(約需l 2h)即得到具有彈性的PVC膜。用打孔器切下直徑10 mm的圓片並用含5％PVC的THF溶液粘於PVC電極桿端,放置數小時,晾乾後電極桿內充以0.1mol／L的水楊酸鈉溶液作為內參比溶液並以Ag／AgCl絲作為內參比電極導出至離子計。電極使用前需於0.01mol／l水楊酸鈉溶液中浸泡2h進行活化處理。電極及備用膜長期不使用時可洗凈後．置於氮氣氛圍下保存。在此條件保存，電極的各項性能指標至少可於5個月內維持穩定。
阿司匹林制劑的分析：待測樣品的處理： 阿司匹林易水解得到水楊酸根離子，且反應定量。因此，通過對水楊酸根離子的測定即可得出樣品中的阿司匹林含量。阿司匹林片(A)和復方阿司匹林片（B）均處理如下：將適量葯品(10片)研製成粉狀，精密稱取1—1．5g．在0.5mol／L NaOH溶液25m1中加熱迴流1h後過濾，定容至250 ml。吸取lOm1濾液，用稀硫酸調至pH 5．5，再用PH 5．5的磷酸鹽緩沖液定容至100 mI作為待瀾液。使用所配電極通過標准溶液法和樣品加入法．分別測定葯品A和B經前述處理後所得試樣中的水楊酸根離子濃度，通過換算得出葯劑中阿司匹林的含量
1．3 HPLC法測定阿司匹林片的含量
儀器與試葯 儀器：高效液相色譜儀；CLASS—LC工作站。色譜柱：ODS C18色譜柱(150mm x 4．6mm，填料：Kromasil，粒度：5um)。 試葯 阿司匹林對照品，甲醇(色譜純試劑)，冰醋酸、鹽酸(分析純試劑)。
取本品20片，精密稱定，研細，精密稱取適量(約相當於阿司匹林10mg)，置100m1量瓶中，加0．1mol/l鹽酸溶液適量，超聲使阿司匹林溶解，放冷至室溫，加0．1mol/l鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液5m1，置25m1量瓶中，加0．1mol/l鹽酸溶液稀釋至刻度，格勻，取20ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖。另取阿司匹林對照品適量，加0．1mol/l鹽酸溶液溶解並稀釋製成每l m1中約含阿司匹林20ul的溶液，取20ul同法測定。按外標法以峰面積計算，即得。
1．4動力學光度法測定痕量乙醯水楊酸
原理：碘對Ce4+和As的氧化還原反應有明顯的催化作用，乙醯水楊酸和碘容易發生取代反應，使碘的濃度降低，導致碘的催化作用減弱，由此建立動力學光度法測定痕量乙配水楊酸的新方法。
儀器和試劑：721型分光光度計；PHS—3C酸度計；超級恆溫水浴。0．01mol/lCe(SO4)2 0．013mol/L AS2O3，5mol/l H2S04 , 5mg/l KI用時稀釋至0．25mg/l ;150mg/l乙醯水楊酸標准溶液用時稀釋至所需濃度；5％醋酸馬錢子鹼；實驗用水為二次蒸餾水。
實驗方法:於一系列25m1比色管中准確加入0．25mg/lKI溶液1．0m1，5mol/l H2S04溶液1．25m1，0．013mol/L AS2O3溶液1.0ml，乙酸水楊酸標准溶液(或樣品溶液)，加蒸餾水至25m1刻度線。搖勻並放人35土0．1度的水浴中，恆溫後加入0.01mol/l Ce〔S04)2 1.0ml，立即搖勻，迅速放回水浴中。反應10min後，加入0.5mol/l,0.5％的醋酸馬錢子鹼終止反應並與Ce4+—顯色，置於沸水浴中煮沸3min，取出冷卻至室溫。用1cm比色皿，在波長520nm處，以蒸餾水為參比，測定吸光度A。
2．以阿司匹林為主葯的含量測定
雖然其成分組成有差異，但大多仍是根據阿司匹林的化學或色譜性質加以分離並測定其含量。
2．1反相高效法相色譜法測定阿司匹林可待因片中阿司匹林含量
儀器和試劑：Hp-1050液相色譜儀及UV檢測器，HP3396積分儀。磷酸可待因對照品、阿司匹林對照品 。甲醇、醋酸鈉、冰醋酸均為分析純試劑，阿司匹林磷酸可待因復方制劑(試製品)。
液相色譜條件：色譜柱ODS C18(10mm，300mm×4mm) 流動相：甲醇—0．03mol/L—l醋酸鈉(冰醋酸調pH＝3．5)(1：2．5)；檢測波長：280nm；流速：1ml/min.
測定方法
混合對照品溶液配製 准確稱取在105℃乾燥至恆重的磷酸可待因對照品適量。用水溶解，配製成濃度為0.8mol/l的溶液。准確稱取阿司匹林對照品約40ml置10mL容量瓶中。加入甲醇2—3mL，溶解，精密加入上述磷酸可待因溶液1.0mL，用水定容至刻度，搖勻即得。
供試品溶液配製 精確稱取樣品細粉適量(約相當磷酸可待因8mg阿司匹林400mg)置100mL容量瓶中，加入25％甲醇溶液50mL，超聲溶解5min。用25％甲醇溶液稀釋至刻度，格勻。經0.45um微孔濾膜濾過，取續濾液為供試品溶液.
測定 精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各10uL，分別注入液相色譜儀中。記錄峰面積。根據混合對照品溶液中磷酸可待因和阿司匹林的峰面積，計算出供試品溶液中二者的含量.
2．2小兒退熱靈片紫外摺合光譜測定
原理：摺曲線分析法是一種數學變換方法(它的數學屬性是一種新的復合導數變換)。它根據諧波分析原理，將光譜吸收曲線看作是多個數學分量加權而成。由於它提供的信息量大，可以顯示吸收曲線的細微差異，以減少相似組分的數學相關性，所以在物質定性和混合物定量方面具有明顯的優點。
儀器與試葯：UV／VIS W型裙合光譜儀及裙合光譜軟體；阿司匹林(1)對照品(含量99．89％)、苯巴比妥(2)對照品(含量99．92％)和輔料(佳木斯化學制葯廠)；小兒退熱靈片
方法與結果：對照品溶液的配製：分別精密稱取1、2對照品適量，用0．1mol／LNaOH溶液(溶劑)溶解稀釋製成1mg／m1的儲備液。再用溶劑稀釋製成適當濃度的溶液(約120ug／m1，22．0ug／m1，使1和2的吸收度在0.2—0．8)，備用。模擬樣品的配製 按原黑龍江地方標准葯品處方比例稱取1、2與適量的輔料混勻後，精密稱取0．2g置小燒杯中，用溶劑溶解並定容至100m1，靜置10min，再取5m1稀釋至250m1。分別吸取16、17、18、19和20m1置各25m1量瓶中，用溶劑定容，得1濃度為20—25ug／m1、2濃度為2．0—2．5ug／m1的模擬樣品溶液(使1和2的吸收度在0．2—1．2)，共5份。
樣品測定：取本品12片，精密稱定，研細，精密稱取細粉適量(約相當於10．110g，20．011g)，用少量溶劑溶解後定容至50m1。按「2．3」項下方法選定的最佳摺合區間(245—295nm)，經摺合光譜自動採集該區間的光譜信息，以兩組分定量分析系統軟體進行裙合運算，並計算得含量
2．3近紅外漫反射技術測定精氨酸阿司匹林的含量
原理：近紅外定量分析需要一個待測成分已知的標准樣品集(簡稱標樣集)，根據標樣集中樣品的近紅外光譜運用化學計量學方法建立光譜特徵值(如吸光度)與待測成分之間的數學關系(簡稱數學模型)。當測定未知樣品時，只需測定該樣品的近紅外光譜，然後用已建好的數學模型預測出待測成分的含量。與常規的光譜定量分析不同之處是，近紅外光譜分析時所用樣品可以不經預處理，通過求解光譜矩陣與待測成分的濃度矩陣來建立數學模型，進行定量。檢測固體樣品一般採用漫反射技術，對於液體樣品的檢測用透射方法。建立數學模型的方法主要有：多元線性回歸、主成分法、偏最小二乘法等。貼演算法相對而言是一種較新的多元數據處理技術，它與逐步回歸、主成分回歸的顯著差異在於考慮全譜區各波長是光譜參數的同時，還兼顧了被分析樣品內部各成分之間的關系，因此在NIR分析中得到廣泛應用。
儀器：Bruker公司VECTOR22/N近紅外光譜儀,帶漫反射光纖探頭波長區間4000-11000cm-1
樣品: 精氨酸阿司匹林固體粉末含阿司匹林48．0％-53．0％, 蔗糖酯(片劑輔料，作為潤滑劑)
實驗方法：用1／1000扭力天平準確稱取不同比例的精氨酸阿司匹林與蔗糖酯，共10份，分別混合均勻，用壓片機壓片，得到精氨酸阿司匹林含量不同的片劑(以此含量做為精氨酸阿司匹林片的理論含量一真值)，每種各100片。從每種100片中隨機選取10片，用儀器的漫反射光纖探頭壓住葯片，每片正反面各測1次，取平均光譜做為樣品光譜。掃描區間為4000-11000cm-1，解析度為8cm-1。用Bruker公司Bruker公司quant/2軟體分析，光譜數據採用加性散射校正預處理，以消除葯片表面不同引起的誤差，即可得到測量值。
2．4阿司匹林精氨酸鹽注射液含量測定
儀器與試葯： 儀器 79—l電磁攪拌儀；紫外—可見分光光度計。精氨酸，阿司匹林，其餘試劑均為分析純。
標准曲線的繪制：精密稱取阿司匹林結晶250．0 mg，懸浮於250mL蒸餾水中，在40一50度水浴中不斷攪拌至溶解，冷卻後移入500 ml量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。精密吸取l，2，3，4，5mL分別置於50 mL量瓶中，加25mL蒸餾水，用o．1mol/LNaOH溶液調節pH至9一10，在沸水浴中加熱5min，冷卻後，用0.1mol/l鹽酸溶液調節pH至3.0一4.0，加5滴硫酸鐵銨指示液，再加蒸餾水至刻度，搖勻。在530 nm波長處測定吸收度A。線性回歸得方程.
測定含量：精密稱取阿司匹林精氨酸鹽400．0 mg置l00mL量瓶中，加蒸餾水溶解，稀釋至刻度，搖勻，過濾。取續濾液5mL，置50 mL量瓶中，在沸水浴中加熱數分鍾，冷卻，加25mL蒸餾水，以下同標准曲線項下處理，在530 nm波長處測定吸收度A，計算阿司匹林精氨酸鹽的含量。阿司匹林精氨酸鹽的含量＝(測定值／稱量值)×loo％，代入數據求得阿司匹林精氨酸鹽的含量.
3．阿司匹林體內葯物分析：
3．1反相高效波相色譜法測定阿司匹林血葯濃度
1 儀器與試葯：Waters2690高效液相色譜儀，配置有996二極體陣列檢測器及Millennium數據處理系統；旋渦混合器(上海青浦滬西儀器廠)；TGL—16高速離心機(上海醫用儀器廠)。 水楊酸、苯甲酸對照品(中國葯品生物製品檢定所)；磷酸為分析純，乙睛為色譜純；水為超純水。
色譜條件：色譜柱為Diamonsil C18柱(4．6mm×250mm，5um)，流動相為甲酵—乙睛—0．2％磷酸(18：32：50)，檢測波長為237nm，流速為1.0ml／min。
溶液配製： 精密稱取10．10mg水楊酸對照品，用甲酵溶解，並定容至10ml，得到1．010mg／L水楊酸的儲備液，並用甲醇稀釋成不同濃度的系列溶液。精密稱取10．44mg苯甲酸，用甲酵溶解，並定容至10ml，得到1．044mg/l苯甲酸的儲備液。取lml儲備液，用甲醇稀釋至loml，得到104．4ug／ml的內標工作液。
樣品處理與測定：精密量取血清樣品0．5nl，加入內標苯甲酸溶液(104．4ug／m1)50ul，乙睛2ml，旋渦振盪2min，15000r／min離心5min，取上清夜20ul，在上述色譜條件下進樣，分別記錄內標與樣品的色譜圖與峰面積。按外標法以峰面積計算，即得。
討論
阿司匹林及其制劑有多種分析方法，但有其共同點。HPLC分析中，檢測柱一般多採用C18柱，檢測波長為280左右。滴定法都是根據葯物中含游離羧酸的酸性進行滴定，或水解後用酸回滴。其他以數學模型等方法進行的測量，也都是基於阿司匹林的化學結構和性質。
參考文獻：
劉 冬，阿司匹林制劑的電極法測定，中國醫葯工業雜志，1997，28（11）：512
王曉燕，高效液相色譜法測定復方阿司匹林片劑的含量，沈陽葯科大學學報，2002，9（1）：31
楊 軍，動力學光度法測定痕量乙醯水楊酸，新鄉師范高等專科學校學報，2001，15（2）：77
南 楠，反相高效法相色譜法測定阿司匹林可待因片中磷酸可待因和阿司匹林的含量，葯物分析雜志，1999，19（1）：7
侯 巍，小兒退熱靈片中兩組分的紫外裙合光譜測定，中國醫葯工業雜志，2004，35（3）：162 喬 梁，應用近紅外漫反射技術測定精氨酸阿司匹林的含量，葯物分析雜志，1998，18（5）：297
張曉雲，阿司匹林精氨酸鹽注射液的制備及其穩定性研究，西北葯學雜志，2004，19（2）：71
張 麗，反相高效波相色譜法測定阿司匹林血葯濃度，中國葯房，2003，14（5）：289
F. 呋喃西林代謝物
呋喃西林（furacilin）是一種人工合成的廣譜抗菌葯，可以治療畜牲疾病。近年來在畜牧、水產養殖中被廣泛應用，但呋喃西林及其代謝物在動物源性食品中的殘留可以通過食物鏈傳遞給人類，長期攝入會引起各種疾病，對人體有致癌、致畸胎等副作用。美國、澳大利亞、加拿大、日本、新加坡、歐盟等已明文規定禁止在食品工業中使用該類葯物，並嚴格執行對水產中硝基呋喃的殘留檢測。日本肯定列表中已明文規定呋喃類葯物在動物源性食品中不得檢出。我國在2002年3月由農業部發布的《食品動物禁用的獸葯及其它化合物清單》中將呋喃西林列為禁用葯。
北京望爾科研人員通過不懈的努力，經過近長期的辛勤工作，終於攻克了技術上的重大難關，在世界上率先首家研製出呋喃西林代謝物ELISA快速檢測試劑盒。該試劑盒採用酶聯免疫技術分析方法研製，通過檢測呋喃西林代謝物為主，以此間接測試呋喃西林。用HPLC和LC-MS-MS方法對比驗證。測定結果表明ELISA檢測試劑盒測定結果與HPLC或LC／MS測定結果相符合。且ELISA檢測試劑盒具有靈敏度高、特異性強、定量判定準、樣本前處理簡單、檢測速度快等優點，適合於一次性大批量樣本快速篩選。可用於動物組織（肌肉、肝臟）、蜂蜜、腸衣、牛奶以及水產品等樣品中呋喃西林代謝物殘留的檢測。
G. 從植物葉片中提取復合氨基酸
我也是從網上查到的你可以參考一下
1.3 方法�
1.3.1 供試樣品的制備�
採取3個月生植株上的完整健全葉片，在80℃乾燥箱中烘乾，粉碎，准確稱取0.5 g於10 mL安瓿瓶中，加入6 mol/L的HCl 7 mL，充入高純N2，將安瓿瓶封口，置於105℃恆溫乾燥箱中消化過夜。冷卻後過濾，濾液濃縮近干，加5 mL0.1 mol/L的HCl溶解，取1.5 ml至1.5 ml離心管中，10000轉/min離心10 min，取上清液900 ul加入100ul 5nmol/ul內標物SAR，混勻後作為供試樣品。�
1.3.2 標准溶液的制備�
5 nmol/L內標液制備：精密稱取SAR 22.3 mg以0.1 mol/L HC1定容至50 mL。�
500 pmol/L內標液制備：精密吸取5 nmol/L內標液5 mL以0.1mol/L HC1定容至50 mL。�
900 pmol/L氨基酸混合標液制備：精密吸取900 ul 1000pmol/L氨基酸混合標液加入5 nmol/L內標液100 ul；�
225 pmol/L氨基酸混合標液制備：精密吸取900 ul 250pmol/L氨基酸混合標液加入5 nmol/L內標液100 ul；�
90 pmol/L氨基酸混合標液制備：精密吸取900 ul 100pmol/L氨基酸混合標液加入5 nmol/L內標液100 ul。�
1.3.3 色譜條件�
樣品自動柱前衍生化程序：吸取硼酸緩沖液5 ul，再吸取OPA試劑1 ul，洗針1次，吸取樣品1 ul，原位混合6次。吸取FMOC試劑1 ul，洗針1次，原位混合3次，進樣。�
色譜柱：Hypersil AA-ODS C18 2．1×200 mm�
流動相A：醋酸鈉1.36±0.025 g，加入純水500 mL溶解，加EDTA溶液50 ul，再加三乙胺90 ul，用1％-2％ 醋酸調pH= 7.20±0.05，再加入四氫呋喃1.5 mL，混合均勻。�
流動相B：醋酸鈉1.36±0.025 g，加入純水100 mL溶解，用1％一2％ 醋酸調pH=7.20±0.05，將此溶液加至乙腈200 mL和甲醇200 mL的混合物中，並混合均勻。 �
柱溫：40℃ 紫外檢測波長：338 nm；�
梯度洗脫：流動相A：以0.45ml/min在0-17min由100%減至40%，17min-18min由40%減少至0；流動相B：以0.45ml/min在0-17min由0增至60%，17min-18min由60%增至100%，18.1min-23.9min流速由0.45ml/min-�0.80ml/min�，運行至24min結束。�
1.3.4 測定方法和數據處理�
分別精密量取對照品溶液和供試樣品各1 ul，注入液相色譜儀，記錄色譜圖至脯氨酸峰出峰後即得。以3種濃度的標樣製作校正表，按Agilent公司提供的氨基酸分析軟體包進行數據處理。�
2 結果與分析�
2.1 紫蘇屬植物葉片中氨基酸組成及含量比較�
27份材料葉片中均測得17種氨基酸，其氨基酸種類較齊全。所測氨基酸中以甘氨酸平均含量最高，達6.68mg/g，其次是亮氨酸和谷氨酸，分別為4.77mg/g和4.59mg/g。與人體健康關系最為密切的賴氨酸平均含量有1.87mg/g。7種必需氨基酸總量平均為14.58mg/g，占氨基酸總量的比例為32.43%。�
氨基酸總量超過50 mg/g的材料共有6份（P06-11紫、P06-6、P06-7、P06-12紫、P06-15紫、P06-13），其中材料P06-7氨基酸總量最高，達57.65mg/g ，較總含量最低的材料P06-33多23.07 mg/g。17種氨基酸中有9種氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸）含量均以P06-7最高，而有6種氨基酸（絲氨酸、甘氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸）含量的最低值出現在P06-33中。必需氨基酸含量變化范圍在11.10 -19.55 mg/g之間，仍以P06-7為最高。非必需氨基酸含量的變化趨勢與氨基酸總量的變化趨勢大致相同。�
�
各氨基酸在材料間的變異較大。變異系數最大的是脯氨酸，達59.19%，其次是組氨酸和賴氨酸，分別為29.91%和25.63%。異亮氨酸的變異系數最小，為11.34%，其它氨基酸的變異系數均在10%-20%之間。氨基酸總量、必需氨基酸和非必需氨基酸含量的變異系數在10%-15%之間。
H. 醋酸地塞米松的葯理毒理
腎上腺皮質激素類葯，其抗炎、抗過敏、抗休克作用比潑尼松更顯著，而對水鈉瀦留和促進排鉀作用很輕，對垂體-腎上腺抑製作用較強。
1、抗炎作用：本產品可減輕和防止組織對炎症的反應，從而減輕炎症的表現。激素抑制炎症細胞，包括巨噬細胞和白細胞在炎症部位的集聚，並抑制吞噬作用、溶酶體酶的釋放以及炎症化學中介物的合成和釋放。可以減輕和防止組織對炎症的反應，從而減輕炎症的表現。
2、免疫抑製作用：包括防止或抑制細胞介導的免疫反應，延遲性的過敏反應，減少T淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性細胞的數目，降低免疫球蛋白與細胞表面受體的結合能力，並抑制白介素的合成與釋放，從而降低T淋巴細胞向淋巴母細胞轉化，並減輕原發免疫反應的擴展。可降低免疫復合物通過基底膜，並能減少補體成分及免疫球蛋白的濃度。 取本品約25mg，置25ml量瓶中．加甲醇17ml使溶解，加0.075mol/L醋酸鈉緩沖液（pH4.5）（取醋酸鈉10.2g，加水溶解並稀釋至1000ml，搖勻，用冰醋酸調節pH值至4.5±0.05）稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液:另取醋酸氫化可的松約10mg，置10ml量瓶中，加甲醇7ml使溶解，加0.075mol/L醋酸鈉緩沖液（pH4.5）稀釋至刻度．搖勻，精密量取1ml與供試品溶液1ml，置同一100ml量瓶中．加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液，照高效液相色譜法（附錄Ⅴ D）測定，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-四氫呋喃-0.075mol/L醋酸鈉緩沖液（pH4.5）（30:10:60）為流動相，檢測波長為242nm，醋酸地塞米松峰與醋酸氫化可的松峰的分離度應大於11.0。
取對照溶液20μl，注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，使醋酸地塞米松峰的峰高為滿量程的35%-40%。再精密量取供試品溶液與對照溶液各20μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍。供試品溶液的色譜圖中如有雜質峰，單個雜質峰面積不得大於對照溶液中醋酸地塞米松峰面積的1/2；各雜質峰面積的和不得大於對照溶液中醋酸地塞米松峰面積。 供試品用甲醇溶解並稀釋成一定濃度的溶液，進入高效液相色譜儀進行色譜分離，用紫外吸收檢測器，於波長240nm處檢測醋酸地塞米松的吸收值，計算出其含量。
照高效液相色譜法（附錄Ⅴ D）測定。 色譜條件與系統適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水（70:30）為流動相；檢測波長為240nm。理論板數按醋酸地塞米松峰計算不低於1500，醋酸地塞米松峰與內標物質峰的分離度應符合規定。 內標溶液的制備 取甲睾酮，加流動相製成每1ml中的含0.20mg的溶液，即得。 測定法 取醋酸地塞米松對照品約13mg，精密稱定，置50ml量瓶中，加甲醇35ml使溶解，用水稀釋至刻度，搖勻。精密量取此溶液與內標溶液各5ml，置25ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻；取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖:另取本品適量，同法測定。按內標法以峰面積計算，即得。 1. 甲醇（色譜純）
2. 水（色譜純）
3. 甲睾酮 1. 儀器
1.1 高效液相色譜儀
1.2 色譜柱
十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，理論板數按醋酸地塞米松峰計算應不低於1500，醋酸地塞米松與內標物質峰分離度應符合規定。
1.3 紫外吸收檢測器
2. 色譜條件
2.1 流動相：甲醇-水= 70 30
2.2 檢測波長：240nm
2.3 柱溫：室溫 1. 對照品溶液的制備
取醋酸地塞米松對照品約13mg，精密稱定，置50mL量瓶中，加甲醇35mL使溶解，用水稀至刻度，搖勻，精密量取該溶液與內標溶液各5mL，置25mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。
2. 供試品溶液的制備
取本品適量，同上。
3. 內標溶液的配製
取甲睾酮適量，加甲醇製成每1mL中約含0.2mg的溶液，即得。
註：「精密稱取」系指稱取重量應准確至所取重量的千分之一。「精密量取」系指量取體積的准確度應符合國家標准中對該體積移液管的精度要求。 醋酸地塞米松
Cusuan Disaimisong
Dexamethasone Acetate
書頁號：2005年版二部－842
[刪去]
【性狀】 熔點 本品的熔點（附錄Ⅵ C）為223 ～233 ℃，熔融時同時分解。
[增訂]
【鑒別】 (5) 在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰的保留時間應與對照品溶液主峰的保留時間一致。
[修訂]
【檢查】 有關物質 取本品適量，用流動相溶解並稀釋製成每1ml中含0.5mg的溶液，作為供試品溶液（臨用現制）。取地塞米松對照品適量，加流動相溶解並稀釋製成每1ml中約含0.5mg的溶液，精密量取1ml，加供試品溶液1ml，置同一100ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。照含量測定項下的色譜條件，量取對照溶液20μl，注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，使醋酸地塞米松峰的峰高約為滿量程的30%。供試品溶液的色譜圖中如有與對照溶液中地塞米松相應的色譜峰，按外標法以峰面積計算，含量不得過0.5%；其他單個雜質峰面積不得大於對照溶液中醋酸地塞米松峰面積的1/2（0.5%），各雜質峰面積（與地塞米松相應的雜質峰面積乘以1.13）的和不得大於對照溶液中醋酸地塞米松的峰面積（1.0%）（供試品溶液中任何小於對照溶液醋酸地塞米松峰面積0.01倍的色譜峰可忽略不計）。
【含量測定】 照高效液相色譜法（附錄Ⅴ D）測定。
色譜條件與系統適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水(40:60)為流動相，檢測波長為240nm。量取有關物質項下的對照溶液20μl注入液相色譜儀，出峰順序為地塞米松峰、醋酸地塞米松峰，地塞米松峰與醋酸地塞米松峰的分離度應大於20.0。
測定法 取本品適量，精密稱定，加甲醇溶解並稀釋製成每1ml中約含0.05mg的溶液；精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取醋酸地塞米松對照品適量，精密稱定，加甲醇製成每1ml中約含50µl的溶液，同法測定。按外標法以峰面積計算，即得。
I. 硝基呋喃衍生原理
硝基呋喃類原型葯在生物體內代謝迅速，無法檢測。但其代謝產物因和蛋白質結合而保證長時間穩定存在。所以一般以硝基呋喃類葯物代謝物為目標分析物的檢測，來達到檢測硝基呋喃類葯物殘留量的目的。
檢測前處理
在檢測前一般需要對樣品進行處理，一般分為洗滌、水解和衍生化及凈化等處理步驟，下面以國家標准檢測方法(GB/T20752-2006)和行業標准方法(SN/T 1627-2005)為例介紹一下檢測前處理的一般步驟。
洗滌
GB/T20752-2006:2g均質好的樣品，15ml的甲醇-水(2+1)，混勻1min，4000rmp離心，棄掉上清液。
SN/T 1627-2005:1g組織，不用洗滌。
水解和衍生化
GB/T20752-2006:加入20ml 0.2M鹽酸，加入0.3ml的衍生化試劑(75mg 2-硝基苯甲醛溶於10ml二甲基亞碸，0.05M)，37℃避光振盪16h。
SN/T 1627-2005:加入30ml 0.125M鹽酸，加入1ml的衍生化試劑(100mg 2-硝基苯甲醛溶於12.5ml二甲基亞碸)，37℃避光振盪16h。
凈化
GB/T20752-2006:加入5ml 0.1M的磷酸氫二鉀，並用1M氫氧化鈉調pH到7.4，離心上清液過HLB柱，5ml乙酸乙酯洗脫，40 ℃ 吹乾，定容到1ml(10ml乙腈+0.3ml，用水定容到100ml)
SN/T 1627-2005:加入4ml 1M的氫氧化鈉，並用1M鹽酸和0.1M氫氧化鈉調pH到7-7.5，3000rmp離心10min，上清液倒入250ml的分液漏斗中，殘渣用5ml水洗， 3000rmp離心10min，上清液也倒入250ml的分液漏斗中，加乙酸乙酯40ml，振搖1ml，靜置3min，重復提取1次，合並乙酸乙酯，通過裝無水硫酸鈉的漏斗過濾至雞心瓶中，50 ℃ 旋蒸至3-5ml，再轉移到試管中， 50 ℃ 吹乾，定容至1ml(0.1%乙酸:乙腈:甲醇 3:3:2)。
檢測方法
經過對樣品檢測前的處理後，就可以對樣品中的硝基呋喃類葯物代謝物殘留量進行檢測，有關豬肉、禽肉、水產品中硝基呋喃類葯物代謝殘留量測定的方法，國家有相應的檢測標准，也有相關的行業標准，另外文獻報道也有一些檢測方法。國家和行業標准檢測方法基本是液相色譜法或液相色譜-串聯質譜法，區別在於提取溶液和凈化方法上有差異，以及外標法或內標法定量的不同，檢出限大多為0.5ug/kg。文獻報道有固相萃取液相色譜-質譜法和液相色譜-串聯質譜組合法，其中前者與國家、行業標准檢測方法的檢出限相同，後者檢出限能達到0.03 ug/kg。
J. 如何用液相色譜儀測氨基酸
反相高效液相色譜法測定煙葉中的游離氨基酸
氨基酸是煙草中的一類重要化學物質，在煙草調制、醇化或發酵、加工直至燃燒過程中，游離氨基酸與還原糖之間可發生酶催化及非酶催化的棕色化反應，生成多種具有蒸煮、烤香、爆米花香味特徵的吡喃、吡嗪、吡咯、吡啶類等雜環化合物，某些氨基酸如苯丙氨酸還可自身分解成香味化合物，如苯甲醇、苯乙醇等。氨基酸含量與煙草製品的吃味有著密切的關系，氨基酸在燃燒裂解過程中一般形成具有刺激性的含氮化合物，對煙氣香吃味產生不良影響，個別氨基酸還產生HCN等危害健康的煙氣成分。一般說來，氨基酸含量太高，煙氣辛辣、味苦、刺激性強烈；含量太低時煙氣則平淡無味缺少豐滿度。因此對氨基酸的分析是一項很有意義的工作，二十世紀60年代以來，國內外在這方面做了大量的工作[1-5]。
植物游離氨基酸樣品的制備，國內外採用的提取劑和純化方法各不相同。據文獻報道[6-7]，鹽酸、不同濃度的乙醇溶液均可以用來提取植物組織中的游離氨基酸；提取液純化則有用陽離子交換樹脂、5%磺基水楊酸、活性炭或乙醚等方法。本實驗對不同的提取方式和不同的純化方法進行了對比研究，確定提取煙葉中游離氨基酸的較佳提取劑和純化方法。提取、純化後的樣品，採用OPA、FMOC聯合柱前衍生反相高效液相色譜法對煙葉中的游離氨基酸進行了測定。該方法使帶氨基和亞氨基基團的氨基酸能夠被同時測定，且得到較好的定性定量結果。
1 實驗
1.1 儀器
Agilent公司HP1100型高效液相色譜儀(帶可變波長紫外檢測器和自動進樣器)，PE公司Lambda Bio40 紫外-可見分光光度計。
1.2 試劑
正纈氨酸（Norvaline，內標），OPA ，FMOC，均為色譜純，Agilent公司提供；硼酸緩沖溶液，Agilent公司提供；
醋酸鈉(NaAc)，分析純，中國醫葯（集團）上海化學試劑公司；三乙胺（TEA），四氫呋喃（THF），乙腈（CH3CN），甲醇(MeOH)，均為色譜純，Fisher公司試劑；
氨基酸標樣包括：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、天冬醯胺（Asn）、谷氨醯胺（Gln）、絲氨酸（Ser）、組氨酸（His）、甘氨酸（Gly）、蘇氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、胱氨酸（Cys）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro），均為生化試劑，中國醫葯（集團）上海化學試劑公司；
苯乙烯陽離子交換樹脂（732型），天津樹脂廠。
1.3 樣品處理
將煙葉在烘箱中恆溫40℃烘乾至恆重，粉碎，過80目篩，篩下物為實驗用煙樣粉末，置於廣口瓶中備用。准確稱取煙樣粉末1.000g於乾燥的潔凈試管中，用一定濃度的乙醇溶液室溫超聲波提取半小時，過濾，相同濃度的乙醇溶液洗滌，再提取一次，合並後的濾液用陽離子交換柱洗脫，然後用95ml 4mol/L氨水淋洗陽離子交換柱，淋洗液恆溫濃縮至干，最後用3ml 0.1mol/L稀鹽酸溶液溶解濃縮物，將此溶液離心分離20min，0.45μm微孔濾膜過濾，加入濃度為5nmol/μ1的內標10μ1，定容至50ml，HP1100液相色譜儀進行氨基酸分析。
樣品自動柱前衍生化：Agilent公司G1313A自動進樣器進樣。程序為：吸取5μl硼酸緩沖液，再吸取1μ1 OPA試劑，洗針一次，吸取樣品2μl，原位混合6次。吸取1μl FMOC試劑，洗針一次，原位混合3次，進樣。
1.4 色譜條件
色譜柱：Hypersil AA-ODS C18 2.1×200mm
流動相A：1.36±0.025g醋酸鈉，加入500ml純水溶解，加90μl三乙胺，用1%醋酸調pH=7.20±0.05，再加入1.5ml四氫呋喃，混合均勻。
流動相B：1.36±0.025g醋酸鈉，加入100ml純水溶解，用1%醋酸調pH=7.20±0.05，將此溶液加至200ml乙腈和200ml甲醇的混合物中，並混合均勻。
流速：0.45ml/min
柱溫：40℃
紫外檢測波長: 0～16min， 338nm； 16～25min，262nm
淋洗梯度：見表1
表1 流動相的淋洗梯度表
Table 1 The gradient time table of mobile phase
序列 時間（min） 流動相A（%） 流動相B（%） 流速（ml/min）
1 0.00 100.0 0.0 0.450
2 15.50 40.0 60.0 0.450
3 18.00 0.0 100.0 0.450
4 21.00 0.0 100.0 0.800
5 23.90 0.0 100.0 0.800
6 24.00 0.0 100.0 0.450
7 25.00 100.0 0.0 0.450
1.5 氮基酸的定性
用標樣色譜圖、文獻參照和標樣加入的方法，通過對照保留時間進行定性，對氨基酸的出峰順序加以確認。
1.6 內標法定量
准確移取濃度為10 pmol/μ1、25 pmol/μ1、50 pmol/μ1、100 pmol/μ1、250 pmol/μ1、500 pmol/μ1、1000 pmol/μ1的氨基酸混合標樣100μl於帶內襯管的樣品瓶中，再加入250pmol/μ1內標溶液100μl，充分混合，液相色譜分析，儀器自動計算各氨基酸的標准曲線。
2 結果與討論
2.1 萃取溶劑的比較
氨基酸可溶解於水、乙醇、甲醇、稀酸等，因此它們均可作為煙葉中游離氨基酸的萃取溶劑，傳統的方法是用乙醇和0.1mol/L的鹽酸。實驗發現，乙醇和0.1mol/L的鹽酸萃取方法比較，提取出的煙葉中的游離氨基酸的總量變化不大，但用鹽酸提取的樣品分析時RSD%較大，平均8.51%，其中超過10%的有4個，甘氨酸的RSD%最大為20%；而用乙醇提取的樣品分析時RSD%相對較小，平均5.12%，超過10%的只有1個。而且鹽酸提取液過濾速度慢，需要30-40min，而乙醇提取液過濾只需10min左右；因此，本實驗選擇乙醇作為煙葉中游離氨基酸的萃取溶劑。
2.2 乙醇濃度的選擇
選擇五種不同濃度的乙醇溶液進行了煙樣中游離氨基酸的提取，測定不同條件下提取液中游離氨基酸的總量，結果如圖1。圖中顯示，在乙醇溶液濃度為80%時，煙樣中總游離氨基酸的提取量最大。而且不同濃度下游離氨基酸的RSD%沒有明顯的變化，因此，選擇80%的乙醇溶液來進行煙樣中游離氨基酸的提取。
2.3 不同純化方法的確定
在最佳乙醇溶液濃度下，分別用活性炭加入提取液吸附雜質、乙醚加入提取液萃取分離雜質、5%磺基水楊酸加入提取液沉澱去除雜質和陽離子交換樹脂吸附雜質四種方法進行了純化實驗。結果發現，活性炭作為純化劑時其色譜圖中雜質峰較少，但同時氨基酸峰亦有多個消失，主要是因為活性炭對氨基酸也有較強的吸附，它在吸附雜質的同時也吸附了需要檢測的氨基酸，故活性炭不適合作為純化劑使用。乙醚和5%磺基水楊酸作為純化劑時，雜質去除不完全，其色譜圖均表現為雜質峰較多，湮沒了大量氨基酸峰，且基線漂移嚴重，給定性定量工作帶來困難。當用陽離子交換樹脂進行純化時，其色譜圖中雜質峰較少，基線平穩，氨基酸峰分離較好，均可以進行定性和定量分析，故本實驗選擇了陽離子交換樹脂作為純化手段。
2.4 色譜分離
2.5 線性范圍及標准曲線
分別取濃度為10 pmol/μ1、25 pmol/μ1、50 pmol/μ1、100 pmol/μ1、250 pmol/μ1、500 pmol/μ1、1000 pmol/μ1的氨基酸混合標樣加入等體積的250 pmol/μ1的內標溶液，進行HPLC分析，以氨基酸濃度為橫坐標，氨基酸與內標的面積比為縱坐標，得到各個氨基酸的標准曲線，如表2所示。從表中可以看出，各氨基酸在10-1000 pmol/μ1的濃度范圍內均有良好的線性，各氨基酸標准曲線的線性相關系數均大於0.99。
表2 氨基酸的標准曲線
Table 2 Standard curves of 17 amino acids
氨基酸 線性方程 相關系數
Asp Y=0.007037x+0.004689 0.9972
Glu Y=0.007520x+0.005375 0.9961
Ser Y=0.006903x+0.038212 0.9988
His Y=0.003719x+0.020168 0.9945
Gly Y=0.005851x+0.018235 0.9966
Thr Y=0.006932x+0.021072 0.9978
Ala Y=0.006275x+0.015314 0.9912
Arg Y=0.006088x+0.016113 0.9920
Tyr Y=0.006734x+0.015022 0.9993
Cys Y=0.006004x+0.009876 0.9985
Val Y=0.006432x+0.009932 0.9927
Met Y=0.006574x+0.010346 0.9905
Phe Y=0.005098x+0.019023 0.9962
Ile Y=0.005976x+0.016235 0.9953
Leu Y=0.006044x+0.015332 0.9964
Lys Y=0.006833x+0.010437 0.9969
Pro Y=0.022455x+0.009376 0.9922
2.6 重現性實驗
取雲南C2F99煙樣做平行實驗（n=5），進行煙葉中游離氨基酸含量的檢測，結果發現： Asp和 Glu含量的RSD%分別為8.0%和8.6%，這可能是二者的分離度不高引起的；His的RSD%為9.0%，這可能與其含量較低，分離效果不好有關。其它氨基酸含量的RSD%均處在3%～7%。
2.7 回收率實驗
用標樣加入法進行回收率實驗，結果見表3。 Thr的回收率僅為68.0%，原因可能與其含量較少有關；其它15種氨基酸的回收率在81.0%～110.5%，平均回收率為93.9%，說明該方法的回收率結果令人滿意。
表3 分析方法的回收率
Table 3 Recovery percents of the analytical method
氨基酸 加入量（mg/g煙樣） 樣品含量（mg/g煙樣） 測定值（mg/g煙樣） 差值（mg/g煙樣） 回收率%
Asp 0.200 0.320 0.499 0.179 89.5
Glu 0.200 0.309 0.484 0.175 87.5
Asn 0.200 0.986 1.208 0.222 110.0
Ser 0.200 0.172 0.334 0.162 81.0
Gln 0.200 0.186 0.368 0.182 91.0
His 0.200 0.106 0.297 0.191 95.5
Gly 0.200 0.064 0.279 0.215 107.5
Thr 0.200 0.052 0.188 0.136 68.0
Ala 0.200 0.642 0.835 0.193 96.5
Arg 0.200 0.266 0.463 0.197 98.5
Val 0.200 0.090 0.259 0.169 84.5
Phe 0.200 0.218 0.406 0.188 94.0
Ile 0.200 0.026 0.191 0.165 82.5
Leu 0.200 0.028 0.199 0.171 85.5
Pro 0.200 1.432 1.653 0.221 110.5
Tyr 0.200 0.062 0.245 0.183 91.5
2.8 樣品分析
利用該方法對不同等級的煙葉中游離氨基酸的含量進行了分析，結果見表4。從表中可以看出，在所分析的樣品中，烤煙煙葉中含量最高的氨基酸是Pro，白肋煙煙葉中含量最高的氨基酸是Asp和Asn；白肋煙煙葉中氨基酸的含量高於烤煙煙葉；相同等級的烤煙煙葉，雲南煙葉中的氨基酸含量高於其它產區。
表4 不同等級煙葉中游離氨基酸的含量（mg/g煙樣）
Table 4 Amounts of free amino acids in different
grade tobacco leaves（mg/g tobacco leaves）
氨基酸 雲南烤煙C1F 雲南烤煙C2F 雲南烤煙C1L 雲南烤煙B1F 雲南烤煙B2F 福建烤煙B1F 福建烤煙C1F 四川烤煙C1F 四川烤煙B1F 貴州烤煙C1F 貴州烤煙B1F 貴州烤煙C1L 鄂西白肋中一 鄂西白肋中二
Asp 0.24 0.31 0.60 0.40 0.38 0.37 0.26 0.37 0.26 0.26 0.32 0.35 1.73 1.59
Glu 0.36 0.32 0.21 0.17 0.16 0.11 0.15 0.20 0.30 0.32 0.29 0.25 0.54 0.61
Asn 0.91 0.34 1.50 0.95 0.38 0.18 0.25 0.35 0.32 0.44 0.55 0.48 7.70 7.62
Ser 0.16 0.10 0.18 0.16 0.10 0.12 0.24 0.21 0.19 0.20 0.19 0.15 0.62 0.58
Gln 0.19 0.05 0.22 0.17 0.04 0.06 0.10 0.11 0.10 0.11 0.15 0.10 0.18 0.20
His 0.11 0.02 0.14 0.10 0.06 0.06 0.11 0.09 0.07 0.09 0.08 0.09 0.20 0.22
Gly 0.10 0.09 0.19 0.17 0.07 0.08 0.12 0.15 0.12 0.15 0.13 0.12 0.16 0.19
Thr 0.05 0.05 0.08 0.06 0.05 0.04 0.08 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.19 0.16
Ala 0.65 0.55 0.84 0.69 0.54 0.51 0.65 0.59 0.55 0.48 0.53 0.70 0.57 0.55
Arg 0.29 0.21 0.32 0.28 0.18 0.26 0.32 0.28 0.25 0.33 0.29 0.33 0.48 0.42
Tyr 0.06 0.07 0.06 0.07 0.06 0.05 0.07 0.05 0.06 0.06 0.07 0.06 0.10 0.15
Val 0.10 0.10 0.12 0.11 0.10 0.14 0.15 0.13 0.12 0.15 0.14 0.13 0.21 0.25
Met 0.07 0.07 0.09 0.08 0.06 0.06 0.08 0.08 0.08 0.07 0.09 0.08 0.12 0.13
Phe 0.26 0.12 0.28 0.23 0.10 0.21 0.25 0.21 0.25 0.28 0.30 0.33 0.44 0.59
Pro 1.14 0.83 2.13 1.51 0.69 0.66 1.03 1.23 1.11 1.32 1.18 1.09 0.25 0.35
總量 4.69 3.23 6.96 5.15 2.97 2.91 3.86 4.14 3.86 4.33 4.37 4.31 13.49 13.61
3 結論
本煙葉中游離氨基酸的分析方法採用80%的乙醇作為萃取溶劑，陽離子交換樹脂對提取液進行純化，能夠最大程度地提取煙葉中的游離氨基酸並較好地去除了影響氨基酸測定的雜質，使色譜圖中雜質峰較少；OPA、FMOC聯和柱前衍生使帶氨基和亞氨基基團的氨基酸同時得到測定；良好的梯度洗脫使各個氨基酸峰得到較好的分離，並使定量結果更加可靠。