㈠ 稀有密碼子分析工具 1對1
手頭上的蛋白質表達不順利,想做一下密碼子優化,但是網站只給出CAI一個指標,並沒有具體給出哪些密碼子不利於表達。遍尋網站,很多密碼子分析工具里沒有鏈黴菌這個選項,遂用google 搜索,找到了SMS這個網站。茲對此工具做簡單介紹,需者自取。
SMS(sequence manipulation suite) 里邊有很多DNA分析工具
這里使用 codon plot 對密碼子偏好性進行分析
1,在上方輸入自己的FASTA序列
2,根據目標宿主的密碼子偏好性,輸入 GCG 格式的密碼子表(點擊網頁中的 codon usage database 鏈接,查找宿主,在 Format 里選擇 standard/eubacterial ,並點選第二個復選框輸出GCG格式,返回原網頁,復制粘貼,點submit即可)
3,彈出新的對話窗口,自己分析
㈡ 密碼子優化
在大腸桿菌中進行異源蛋白質的表達時,有時會發現重組蛋白質的表達量很低,給後面的分離純化造成很大的困難。有些技術人員可能比較困惑,表達的蛋白質不是毒蛋白,載體是商用載體,一般商用載體的啟動子效率都很高,這也排除了轉錄水平低的問題。那為什麼蛋白質表達水平還那麼低,這種情況你就要考慮是不是密碼子偏性的問題。
什麼是密碼子偏性呢?可以這么理解,宿主經過千百萬年的進化,密碼子與反密碼子之間已經形成了一個平衡,有些密碼子出現的頻率高,其對應的tRNA水平也就高,密碼子頻率低對應的tRNA水平也就低。如果插入的外源基因上攜帶大量在宿主中頻率很低的密碼子,那麼對應的tRNA就會出現不夠用的情況,宿主首先要保證自身的蛋白質合成,剩下的才能用於異源蛋白質的合成,雖然宿主可以提高tRNA的水平,但對於異源蛋白質來說,合成的晚了或者慢了,就會引起翻譯過程一系列的連鎖減慢,合成的效率就會嚴重下降。
基於這一原理,要提高某一基因在異源宿主中的表達量,常用的策略之一就是將目的基因的稀有密碼子進行同義替換,使之更接近於宿主細胞的密碼子使用方式。通過這種方法,提高外源基因在大腸桿菌宿主中表達量的報道已有很多。
我這里製作了一個大腸桿菌所有密碼子偏好的數據集,表中RSCU代表該密碼子在所有同意密碼子中的相對概率,計算方法為 : [該密碼子出現頻率] / [同義密碼子概率的和] × 同義密碼子個數 。可以根據密碼子RSCU判斷其偏性,進行密碼子替換時,將RSCU值低的密碼子替換成值高的密碼子即可提高異源蛋白的表達量。
同時,也給出兩個做密碼子優化的網頁工具: OPTIMIZER 和 Jcat 。Optimizer進行密碼子優化時會考慮GC含量、密碼子平衡(如果將全部低頻密碼子換成最高頻密碼子,會導致細菌表達壓力過大,不利於自身生長,這也是不行的),還可行規避酶切位點,自己指定參考集等,功能強大,推薦使用該工具。Jcat簡單粗暴,直接將低頻密碼子替換成高頻密碼子。如果你只有蛋白質序列可以使用我自己編寫的一個工具: http://www.liuzhen106.com/tools/103_2.html 。
什麼進化壓力導致了密碼子使用偏性,還沒有定論。一些研究者推斷,密碼子偏性能夠減少同工tRNAs的多樣性,一些稀有密碼子的tRNAs含量較少,有利於生物在快速生長條件下節約部分能量,從而降低了新陳代謝負荷。不管是什麼原因導致了密碼子偏性,但密碼子偏性對異源蛋白表達水平確有深遠的影響。
㈢ 什麼是稀有密碼子稀有密碼子的的功能
遺傳密碼有64種,但是絕大多數生物傾向於利用這些密碼子中的一部分。那些被最頻繁利用的稱為最佳密碼子(optimal codons),那些不被經常利用的稱為稀有或利用率低的密碼子(rareorlow-usage codons)
㈣ 怎麼分析一個基因的稀有密碼子
恩,,說一下原理。首先就是你要有表達載體的遺傳密碼表(大腸桿菌、赤畢酵母之類的),接著你要得到你序列的密碼子使用頻率,最後把這兩個表進行一個對比,就可以得到基因中的稀有密碼子。
具體的內部操作:找到一個使用最多的密碼子,把這個密碼子的分值定為1,然後以這個為標准,其他的密碼子進行打分(因為使用頻率最多的分值為1,所以其它的分值都是小於1的,比如0.8,0.7之類的)。最後對比分值,得分低的就是稀有密碼子。當然這個不用自己做,現在有現成的在線稀有密碼子分析工具,你直接把序列輸進去就可以得到答案了。
㈤ 怎麼分析一個基因的稀有密碼子
NCBI沒數據CodonUsageDatabase查相關物種密碼偏信息
CodonUsageDatabase資料庫用計算密碼偏序列數據都自NCBI術界工業界經使用資料庫該資料庫用物種名索引使用前必須首先搞清楚所研究物種拉丁名(例 Homo sapiens)按字母瀏覽檢索式該資料庫象其物信息資料庫靈其檢索詞要求比較嚴格能原些物種拉丁名非相似(例差數字)差錯差毫釐 謬千反復核物種名應該使用該資料庫重要步驟
要計算單或組基用其提供Countcodon服務()
㈥ 對蛋白無顯著影響轉錄
影響蛋白表達的因素:
1. 載體構建錯誤
這個是很多克隆新人常犯的錯誤,在克隆時弄錯讀碼框,從而導致蛋白不表達。蛋白表達載體構建正確是蛋白表達實驗的基礎,構建載體時要考慮啟動子、多克隆位點、終止子、融合標簽、復制子等多種因素。
2. 宿主菌選擇不當
不同宿主菌的基因型不同,選擇合適的宿主菌對某些特殊的載體進行蛋白表達至關重要。有時表達重組的毒素蛋白,對宿主細胞也有毒性,會造成質粒丟失。
3. GC含量
不同物種間基因組的GC含量有顯著差異,GC含量通常間接對基因表達進行調控和影響,超過70%可能會減低蛋白表達水平。
4. 密碼子優化
(1)密碼子偏愛性
不同物種的基因在密碼子使用上存在著明顯的偏愛性,甚至同物種內不同功能的基因其密碼子使用頻率也存在較大的差異,密碼子偏愛性對重組蛋白的表達具有深刻復雜的影響。
密碼子的偏愛性是通過控制可用tRNA豐度影響蛋白的翻譯過程,tRNA的缺乏可能導致對應的稀有密碼子在蛋白表達過程中使翻譯速率降低甚至終止,從而使蛋白水平顯著降低。
(2)密碼子的使用頻率低。
某些基因本身含稀有密碼子,擁有所用宿主的稀有密碼子越多的基因,越難在該宿主中表達出理想水平的重組蛋白。可選用高頻使用的密碼子替代基因中存在的已選宿主的稀有密碼子,或在排除原始基因中的稀有密碼子的基礎上進行重新合成,同時使密碼子組成頻率更接近宿主。
但是研究表明,密碼子的優化必須與蛋白的高級結構聯系起來,如果通過一味地替換稀有密碼子來提高重組蛋白的表達可能會起到適得其反的結果。
5. mRNA二級結構
mRNA如果形成大而穩定的二級結構如發卡結構和莖環結構,尤其是起始密碼子附近的穩定二級結構,將會影響mRNA在翻譯過程中核糖體的結合和延伸,從而降低翻譯的效率和最終的蛋白表達水平。如果序列里有和核糖體結合位點/或翻譯起始位點互補的序列,由此形成的mRNA二級結構,會讓翻譯嘎然而止,此時就需要進行同義密碼子替換。
因此,合理優化翻譯起始區的mRNA二級結構,將有效提高目的蛋白表達水平。
6. mRNA的穩定性
蛋白的表達調控分為轉錄水平和翻譯水平,一般來說,轉錄水平起關鍵作用,但同時翻譯的效率與mRNA的降解直接相關,因此,也間接影響著轉錄後水平的調控。原核表達中,存在稀有密碼子的mRNA翻譯過程受到影響,使得mRNA得不到更多核糖體結合後的有效保護,也將導致mRNA的降解從而使蛋白積累水平顯著降低。
7. 基因突變
鹼基的缺失、插入或突變,都會對翻譯的蛋白產生影響,在PCR擴增時,鹼基序列突變為終止密碼子,會導致蛋白翻譯意外終止。所以在進行表達之前,通常要進行測序來避免這種情況的發生。
當然,影響蛋白表達的其他要素或優化方法還包括檢查單核苷酸重復和密碼子重復,起始密碼子環境,終止密碼子及其環境,避免內含子、隱蔽剪接位點、AT 富含區、內部核糖體進入位點 (IRES)、重組位點等不利元件,選擇合適的 UTR 序列和信號肽序列,合理設計酶切位點、接頭、融合基因、檢測和純化標簽等,使基因進一步優化,檢查無誤後進行基因合成,以備後續的遺傳轉化和表達。
發布於 2020-10-20 11:22
女性的直覺可信度有多高?
煙雨平生
11 月,我出差的一個晚上,老公發了張洗澡後的照片給我。照片里,他裸著上半身,鏡頭對著盥洗台上的鏡子。他在向我賣弄身材,我卻敏銳的發現,我的小黑瓶換了個位置,從置物架上到了置物架下。他一個大男人,用女生護膚品做什麼?我懷疑家裡有女人,但當時不可能趕回去,也不想打草驚蛇,而且,萬一猜錯了怎麼辦?12 月中旬,我再次出差,並故意提前回來,見他不在家,就給他打電話,他說和哥們兒在酒吧,我直接去了我們常去那家酒吧。他確實和哥們兒在一起,坐在靠窗的卡座里,哥們在起鬨,他和他的「好妹妹」抱著在啃!站在進門處的酒架玄關後,聽著他們高聲地起著哄,我氣得渾身發抖,所有細胞都叫囂著:沖過去,沖過去!撕爛這群混賬!1我老公叫張迪,是我初戀。我不是那種很美的女生,在張迪之前,沒有人追過我。當年張迪追我,我表面矜持,內心卻懷著小慶幸和感激,只假裝猶豫了一個晚上就答應了。他也不是帥氣的男生。我以為丑一點安全,不會在外面招搖。我們很快在一起。我巴心巴肝對他好,我知道他有個白月光,是他的初戀,我看過照片,確實長得比我好。就是他正在啃的那個!一年多來,白月光和她第 N 任男朋友分了,找張迪哭訴。張迪這個萬年備胎,天天請吃請喝安慰她,我雖心裡不舒服,但張迪賭咒發誓,叫我相信他人品,說白月光現在只是他「妹妹」。白月光更是一口一個「嫂子」,一會兒傾慕我的才華,一會兒誇我是業界精英,一會兒說我御夫有術,說張迪對我多好多好……彩虹屁一個接一個,誇得我信以為真。加上白月光確實漂亮,和張迪站在一起,活脫脫一朵鮮花插在牛糞上,漸漸地,我對他們失去防範。上個月領證時,白月光還專門請我們吃飯,祝我們白頭到老,說最幸運的事情就是通過張迪認識了我這個嫂子!如今……這算什麼?!我冷靜下來後,掏出手機,「啪啪啪」把他們抱著啃的場景拍下來。萬事都要講證據,就算離婚,就算鬧上法庭,誰主張誰舉證,我得呈上個東西。從這家酒吧出來,我到隔壁酒吧,找了個能看見這邊門口的位置,點了杯威士忌加冰。一個多小時後,那對狗男女摟摟抱抱上了同一輛計程車,我尾隨而至,竟看見他們回到我和張迪的住處!這是我們專門為結婚買的房子,剛搬進來不到半年。這簡直是赤裸裸的侮辱!我坐在計程車上,指甲深深掐入肉里,眼睛瞪得生疼,腦海里全是沖上去手撕賤人,又或者捉姦在床的場景……然而,理智告訴我:這個時候手撕,結果不外乎簡簡單單離婚,對他們沒有半點損傷,甚至有可能,這兩人聯合起來把我揍一頓!這年頭,社會新聞版,原配捉姦,老公連同小三把原配揍一頓的事兒還少了嗎?「小姐,你下車嗎?」「不了。」我報了附近一家酒店的名字,我需要好好想想下一步怎麼做,他們的軟肋是什麼。2幾分鍾後,張迪的電話打過來。我看著來電顯示上「老公」二字,想起回來時放在客廳里的行李箱,迅速揉了揉臉,深吸了口氣,這才接起電話——「老婆,你在哪兒呢?是不是回來了?我剛從酒吧回來,喝高了。」他的聲音滿是疲憊,裝得很像。「我回報社了,專題出了點問題,所有人都在加班,不知道要忙到幾點!」我忍著惡心,語氣暴躁,「哎,先不給你說了,煩死了!這工作還有完沒完!」「那你快忙,我等你。」張迪掛了電話。我冷笑。等我?怎麼等?和白月光滾床單等嗎?這種事情,從前發生了多少次?剛才他們進門時,看見行李箱嚇一跳吧?!我買的房子,憑什麼睡酒店的是我?!我今天的所有委屈,都要他們加倍奉還!那天夜裡,我徹底失眠,一直在盤算……3第二天一早,我正在洗漱。張迪給我打電話,肉麻問我工作做完了嗎?說心疼我,愛我,叫我忙完後趕緊回家休息。我對著鏡子翻白眼,嘴癢癢想問他「床單洗了嗎?房間通風了嗎?騷味兒還有嗎」,忍下後回答,「剛忙完,和同事吃個早飯就回。」上午 10:00,我回到小區。【第一件事不是回家,而是到小區物管處。】我謊稱家中失竊,要求調取我們那層樓的監控。物管小妹妹認識我,帶我到監控室,還專門給我勻了台電腦。我頭天晚上已經把最近半年的出差時間列出來,坐在電腦前一個個時間段的找。那兩個人,果然不要臉,每次還沒進門,就已經抱著啃了起來。我們小區的監控視頻保存時間是三個月,我在三個月的時間段里,找了四段他們抱著啃進門的視頻。麻痹,要搞到外面去搞!我趁著沒人注意,迅速用小 U 盤把那幾段拷貝下來。【第二件事才是回家。】戰場打掃得很乾凈,能打開的窗戶都打開了,被褥疊得整整齊齊,垃圾桶里半點垃圾都沒有。我的行李箱已經收拾好了,臟衣服丟在洗衣機,干凈衣服掛在衣櫃里。若不是親眼目睹了昨夜的一切,我怕還會繼續以為找到了真愛且體貼我的男人。我坐在沙發上,隨手拿起放在沙發扶手上的 iPad,【打開微信】。這個男人,因為喜歡「吃雞」(打游戲《和平精英》),微信常年登錄狀態。我先看了他和白月光的【聊天記錄】。刪得並不幹凈,卻很聰明,言語中沒有任何曖昧,也就是正常約飯的時間地點,且全是我會參加的。我冷哼,打開【「我」-「支付」-「錢包」-「賬單」】,所謂百密一疏,上面每一筆從微信出去的開銷都清清楚楚。發紅包是日常,大大小小都有。然後是酒店的,看時間和價格應該是鍾點房;情趣用品店的,不知道買的是什麼;還有商場,花店,甜品店的眾多開支……這兩個人,挺頻繁的。我沒截圖,而是用手機拍照,免得在 iPad 上留下痕跡。最後才是【打開炒股軟體】。我是財經記者,和圈內很多大佬熟,這幾年跟著他們賺了不少錢,特別是股市。張迪炒股是我手把手教的。他的賬戶密碼都是我給申請的,他沒改密碼,方便我偶爾幫他操作,我拉了流水賬出來,手機錄了段視頻。我和他雖然沒辦婚禮,但在法律上,那是實打實的夫妻。我不圖他的錢,但我也不想我的錢被他算計了!婚前財產好說,婚後這半年還真不好說。有了這兩份流水就不一樣了,我們各自理財,他收入的絕大部分在股市,另一部分,微信支付賬單顯示得清清楚楚,花在白月光身上呢!說來可笑,我和他在一起兩年,共同生活的開銷基本花我的錢。我不是那種有了男朋友,就得讓男朋友養我的人,我家的家庭教育是:【女人經濟要獨立,婚姻才有底氣。】而現實生活,很多時候是:【男人把錢花在誰的身上,就會愛誰多一點,男人心疼錢,就會心疼女人。】4下午 3 點,張迪給我打電話。一是問我休息好了沒,二是約我晚上在外面吃飯,說我「出差+加班」辛苦了,要好好犒勞。「還有誰?」我裝作很隨意地問。「昨天才和兄弟們喝了酒,今天不叫他們了。」張迪想了想,「周月說好久沒見你了,要不我問問她?」周月就是白月光。「行,剛好帶了伴手禮要給她。」我笑著說,「你不許提前說,不然驚喜就沒了!」張迪一口答應,問我怎麼沒有給他買禮物?我心下鄙視,唇邊笑意不減:「當然有了,晚上給你!是你喜歡的。」張迪在話筒那邊親了兩下。這樣親昵的小舉動,我以前受用極了,現在只覺惡心。張迪叫我再休息一會兒,晚上見。我哪敢休息?內心熊熊火焰讓體內每個細胞都在燃燒。我「咻」的站起,先給「跑公安口」的閨蜜打了個電話,三言兩語把事情說了,我需要監聽器,問她除了某寶,還有哪裡能買,立即馬上就要。她說電子城,並給了我一個店鋪的名字。我道了聲謝。閨蜜「哎」了一聲叫住我:「勝男,我可提醒你,監聽這事兒是違法的,用這種方式取得的證據,法院不受理。」「我知道,一旦被抓,情節輕的,《治安管理法》,5 日以下拘留或 500 元以下罰款,重的就《刑法》了。」我說,「放心,不會擴散,更不會蠢到做證據,我會很小心不會被發現,我就想看看張迪到底是人是鬼!」閨蜜再次提醒我小心:罰款事小,留下案底事大。我「嗯」了一聲,飛快洗澡、換衣服、化妝……5吃火鍋的地方是我們經常去的那家。我給白月光送了一支 A 牌的口紅,又配了一支手工唇膏,監聽器貼在手工唇膏的內管底部。我給她說,手工唇膏是我親手做的,出差的時候,有半天閑暇,就在店裡學做了幾支。白月光抱著我的手臂,蹭了又蹭,一個勁兒的誇我能幹,不但會炒股,還心靈手巧,連唇膏都會做。至於 A 牌的口紅,她明顯更喜歡,眼睛裡閃著光,說剛好沒有那個色號,誇我敞亮大氣。張迪在旁邊看著,假裝吃醋地說,我對白月光比對他還好。「那是自然,我比你好看!」白月光撒嬌地瞥了他一眼,「勝男姐若是男生,我肯定主動追求她!」張迪笑著點餐,在菜單上勾勾畫畫。我瞟了幾眼。怎麼說呢?很多細節,當一個人信任另一個人的時候,是不會發現的;可當信任崩塌,每一個細節都是疑點。張迪勾菜品時,最先勾的是白月光喜歡的,然後是他喜歡的,最後才是我愛吃的。我暗罵自己從前蠢,白月光這種存在,根本不該掉以輕心。火鍋吃了一半,張迪和白月光有一搭沒一搭問我,這次出差有什麼收獲?臨近過年,有沒有什麼好股推薦?這是日常話題,每次和他們一群人吃飯,聊得最多的就是股票,基本是我叫他們買什麼,他們就買什麼,也基本都能賺。這一次,我沒立即回答。我說要好好研究一下,買個普通的,和大盤持平沒意思,得找個大牛,狠狠賺一筆。那兩個人眉開眼笑。我也在笑。我不是善男信女,別指望我被綠了後,還幫你們賺錢!6送給張迪的是一個 L 家的錢夾子,比他之前的錢夾子高出了不止兩個檔次。「我以為你就記得周月,看你對她比對我還好。」張迪坐在我旁邊,美滋滋地把各種卡片從老的錢夾子換到新的錢夾子里。「哪能呢?」我削著橙子,心想我 TM 以前真是犯賤,嘴上笑著,「還不是看在你的面子上,說白了,也是想給你爭口氣。我就是想告訴她,沒了她,你一樣過得好,而且能過得更好!」張迪坐的位置在我後方一點,我能很清晰感覺到他看著我。若是以前,我肯定會以為他又被我感動了,如今,我只覺可笑。他心裡想的是「傻瓜」吧!這世上哪有那麼多「感動」與「被感動」,大多數時候我們以為的「感動」都只是「自我感動」。「勝男,你對我真好!」他從後面抱住我。我心裡煩膩,感覺惡心,臟。我不是有潔癖的人,耍朋友之前,他有多少女人都與我無關,可現在,我們是夫妻,他再在外面亂搞,我就覺得臟。我把削好的橙子分一半給他,催促他吃了就去洗澡。他可能誤會了,三兩口把橙子吃完,表示「立即馬上洗香香,為老婆服務」,我笑笑,慢條斯理把另外一半橙子吃完,然後把事先准備好的監聽器塞到錢夾子里。現在的錢夾子,除了身份證經常用,社保卡偶爾用,其他各種卡,銀行卡也好,貴賓卡也罷,一年用不了兩次,基本就是個擺設。我不擔心他會發現,就算發現,不認就是了,再說,我只打算偷聽幾天,等監聽器沒電了,隨便找個機會把監聽器丟了。7監聽器的軟體沒在我日常用的手機上。我頭天買監聽器的時候,順便買了個二手手機,找同城快遞送到報社,收件人是我。那時的我,做夢也沒想到——安上監聽器那一刻,就等於推下了多米諾骨牌的第一塊,之後,每一個骨牌倒下,都彷彿開啟一個潘多拉盒子。人性的惡,像深淵里的龍。 第 2 章 人生是多米諾骨牌快遞放在報社門衛處,我取出手機,迫不及待來到小辦公室,戴上耳機。出乎意料的是,白月光居然還有個男朋友,而且就那麼巧,昨天晚上,她去了男朋友那裡,並把我送給她的唇膏送給男朋友。之後是一大段「嗯嗯啊啊」,停頓處有聊天。白月光問男朋友「什麼時候帶她回家」,抱怨「從來沒見過男朋友的朋友」。男朋友坦然說「家裡不會同意」,說白月光配不上他,還說像他那種家境,肯定要找個門當戶對的。我很不厚道地笑了。被張迪捧在手心的女神,在富二代眼裡,也就是個見不得光的。監聽器有定位,我瞟了眼手機上的位置,對方在我市很出名一個高檔小區,住的人非富即貴。白月光哭唧唧:「你把我當什麼了?pao 友嗎?我一心一意對你,沒想到你是這樣的人!我要分手!」富二代趕緊哄著:「現在是創業期,外人看起來風光,其實一年營收不過幾百萬,和家族企業比起來,不過九牛一毛。」還說等事業做起來了,白月光是唯一同甘共苦的女人,要【送她一輛瑪莎拉蒂做聘禮】!瑪莎拉蒂!我承認,我酸了,世人皆愛綠茶。「你那公司,什麼時候起來啊?」白月光撒嬌地問。「快了快了,等風口。風口一到,豬都能飛到天上去!」富二代親呢地說,然後一大堆對未來的暢想。核心一個詞:區塊鏈。很不巧,因為比特幣的緣故,我了解過區塊鏈,也采訪過國內區塊鏈公司,多少懂一點。富二代那一套說辭,既沒含金量,也沒差異化優勢,甚至還有金融概念模糊不清的地方。我懷疑白月光被騙了。這年頭的富二代,家裡普遍重視教育,無論學識還是見識,都比普通人高許多,在不擅長領域創業的可能性實在太小。8唇膏留在富二代那裡,監聽器同樣留在那裡。我把線路切到張迪那邊,他一上車就撥通了白月光的電話。車載藍牙。我把兩人對話聽得清清楚楚——「醜死了,每天早上醒來嚇一跳,以為旁邊睡了個鬼!月兒,你老公每天就靠著你洗洗眼睛才能活下來……想到還要和母夜叉生活幾年,我就頭發發麻,萬一熬不住怎麼辦?」「那咱們中午老地方見?」白月光吃吃笑,「……想想醜八怪的錢,還有好幾套房子,乖,你再忍忍……我待會兒好好犒勞犒勞你!」張迪「嗯」了一聲,語氣輕佻,「你知道我喜歡什麼。」白月光聲音嬌得都快滴出水了:「知道……討厭得很……」兩人一直撩騷。我心臟位置的那團火,如火山一般,瘋狂的噴涌著!眼睛也痛得不得了。這就是我要嫁的男人……一口一個母夜叉,還自稱是其他人的老公!我的自尊在這一刻被人狠狠踏入泥里,反復摩擦!9我給跑公安口的閨蜜打電話,幾分鍾後,她敲我辦公室的門。開門後,她嚇了一跳:「你眼睛怎麼紅成這樣?……張迪又怎麼了?」我把耳機遞給她,調出車上那段話。她同樣氣得夠嗆,一個勁兒地罵「混蛋,垃圾,人渣」,問我打算怎麼辦?怎麼辦?這可不是簡單的【婚內出 gui】,【嫌我丑了】,張迪明確地表示「只生活幾年」,白月光更是直接提醒他,為了錢和房子!也就是說:這場婚姻,原就是一場算計!我的房子!我的存款!我炒股的眼光!甚至,我爸媽的財產!爸媽只有我一個女兒,我們在老家有三套房子,其中兩套都寫著我的名字,他們說的幾套房子,應該就包括這兩套!我盯著比我大幾歲的閨蜜,半晌咬著牙:「姐,幫我!」10我的眼睛氣得充血了,眼白幾乎看不見,真正恐怖。我跑去醫院開了許多葯,然後順理成章成了病人,不履行妻子義務,每天背對他睡覺。張迪省得看見我的臉,但他又是個慾望很強的人,晚上得不到排解,每天都要找白月光。白月光很忙,一個人應付兩個男人。陪睡不是事兒,真正麻煩的是,她要努力讓自己配得上「富二代」。【她缺錢,缺很多很多錢。】她不止一次問張迪也問我,什麼時候才能選出牛股,最好天天漲停。她想在年前套現一大筆,注資「富二代」的公司,然後趁著過年,作為合作夥伴,也作為女朋友,和富二代回家見家長。當然,這些話不可能給張迪說。她給張迪的版本是:一想到張迪和我結婚就心痛……她想狠賺一筆,不為了錢委屈自己……想張迪早點離婚,他們好早點名正言順在一起。張迪很感動,當天下午沒上班,和白月光在酒店廝混,還給我打電話,說晚上加班很晚才回。我呵呵噠。幾個人中,最忙的是「富二代」。那是個實打實的「海王」,除了周月,還有 ABCD 好幾個女朋友。他比張迪聰明。人設高高在上,「富二代」,「家族企業」,「創業精英」,住豪宅開豪車,擅說甜言蜜語,且出手大方,就我在監聽器里聽到的,每每送出去的,不是頂級護膚品就是奢侈品牌的包。他的眾女友最近有一個共同目標:過年回家見家長。只可惜,時機不利!富二代一會兒要擴大公司規模,一會兒公司偷稅漏稅被查,一會兒打算投資地皮……總之,資金周轉不靈,這時候若帶女友回家,必定遭人詬病。女朋友們有的提出向公司注資,成為股東,有的直接借錢給富二代。富二代承諾所有打算給他拿錢的女人,過年帶她們回家,排除萬難也要在一起!我和閨蜜對視著,異口同聲說了三個字:「殺豬盤!」11「殺豬盤」是詐騙團伙自己起的名字。姑娘們是「豬」,人設和戀愛是「豬飼料」,戀愛過程是「養豬」過程,最後騙取錢財,就是「殺豬」。富二代打算批量殺豬。我和閨蜜第一反應是【報警】,多年記者生涯,特別她跑公安口的,正義感比普通人更重。第二反應才是,我們可以【利用「富二代」狠狠報復白月光和張迪】。選 A 還是 B,我和閨蜜陷入兩難。正如之前《奇葩說》的一期節目:「美術館著火了,一幅名畫和一隻貓,只能救一個,你救誰?」名畫是遙遠的哭聲,那些我們沒有看見的,推測出來的受害人是遙遠的哭聲。貓是近處的哀嚎,我被欺騙的愛情,被摁在地上反復摩擦的自尊是近處的哀嚎。我們最終【選擇了自私】,重新設計了報復的每一步,且把「殺豬盤」列為報復的重要環節。我發誓,這輩子,我從來沒有干過如此爽快的事!
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哇偶偶
你好,請問誘導溫度和溶氧量對蛋白誘導表達過程的影響有哪些,就是小量誘導表達時溫度偏高,到大量誘導表達時考慮到溶氧量不同而降低誘導溫度,這一過程中溫度和溶氧量有什麼關系,為什麼溶氧量低了要降低誘導溫度
2022-09-15
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普健生物
作者
這個問題涉及到發酵。簡單來說,一定條件下溫度越低溶氧含量越高,溫度越高溶氧會降低,當溶氧量降低則會在發酵過程中產生雜菌以及菌體代謝異常等
2022-09-15
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蛋白表達的影響因素
2 年前
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普健生物有五大蛋白表達平台,分別為大腸桿菌表達系統、枯草芽孢桿菌表達系統、酵母表達系統、哺乳表達系統、昆蟲-桿狀病毒表達系統,可以提供從基因設計、基因優化、基因合成、亞克隆、蛋白表達測試、蛋白放大與純化的一站式蛋白表達純化服務。
憑借我們多年的蛋白表達服務經驗,談談影響蛋白表達的因素有哪些。
影響蛋白表達的因素:
1. 載體構建錯誤
這個是很多克隆新人常犯的錯誤,在克隆時弄錯讀碼框,從而導致蛋白不表達。蛋白表達載體構建正確是蛋白表達實驗的基礎,構建載體時要考慮啟動子、多克隆位點、終止子、融合標簽、復制子等多種因素。
2. 宿主菌選擇不當
不同宿主菌的基因型不同,選擇合適的宿主菌對某些特殊的載體進行蛋白表達至關重要。有時表達重組的毒素蛋白,對宿主細胞也有毒性,會造成質粒丟失。
3. GC含量
不同物種間基因組的GC含量有顯著差異,GC含量通常間接對基因表達進行調控和影響,超過70%可能會減低蛋白表達水平。
4. 密碼子優化
(1)密碼子偏愛性
不同物種的基因在密碼子使用上存在著明顯的偏愛性,甚至同物種內不同功能的基因其密碼子使用頻率也存在較大的差異,密碼子偏愛性對重組蛋白的表達具有深刻復雜的影響。
密碼子的偏愛性是通過控制可用tRNA豐度影響蛋白的翻譯過程,tRNA的缺乏可能導致對應的稀有密碼子在蛋白表達過程中使翻譯速率降低甚至終止,從而使蛋白水平顯著降低。
(2)密碼子的使用頻率低。
某些基因本身含稀有密碼子,擁有所用宿主的稀有密碼子越多的基因,越難在該宿主中表達出理想水平的重組蛋白。可選用高頻使用的密碼子替代基因中存在的已選宿主的稀有密碼子,或在排除原始基因中的稀有密碼子的基礎上進行重新合成,同時使密碼子組成頻率更接近宿主。
但是研究表明,密碼子的優化必須與蛋白的高級結構聯系起來,如果通過一味地替換稀有密碼子來提高重組蛋白的表達可能會起到適得其反的結果。
5. mRNA二級結構
mRNA如果形成大而穩定的二級結構如發卡結構和莖環結構,尤其是起始密碼子附近的穩定二級結構,將會影響mRNA在翻譯過程中核糖體的結合和延伸,從而降低翻譯的效率和最終的蛋白表達水平。如果序列里有和核糖體結合位點/或翻譯起始位點互補的序列,由此形成的mRNA二級結構,會讓翻譯嘎然而止,此時就需要進行同義密碼子替換。
因此,合理優化翻譯起始區的mRNA二級結構,將有效提高目的蛋白表達水平。
6. mRNA的穩定性
蛋白的表達調控分為轉錄水平和翻譯水平,一般來說,轉錄水平起關鍵作用,但同時翻譯的效率與mRNA的降解直接相關,因此,也間接影響著轉錄後水平的調控。原核表達中,存在稀有密碼子的mRNA翻譯過程受到影響,使得mRNA得不到更多核糖體結合後的有效保護,也將導致mRNA的降解從而使蛋白積累水平顯著降低。
7. 基因突變
鹼基的缺失、插入或突變,都會對翻譯的蛋白產生影響,在PCR擴增時,鹼基序列突變為終止密碼子,會導致蛋白翻譯意外終止。所以在進行表達之前,通常要進行測序來避免這種情況的發生。
當然,影響蛋白表達的其他要素或優化方法還包括檢查單核苷酸重復和密碼子重復,起始密碼子環境,終止密碼子及其環境,避免內含子、隱蔽剪接位點、AT 富含區、內部核糖體進入位點 (IRES)、重組位點等不利元件,選擇合適的 UTR 序列和信號肽序列,合理設計酶切位點、接頭、融合基因、檢測和純化標簽等,使基因進一步優化,檢查無誤後進行基因合成,以備後續的遺傳轉化和表達。
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㈦ 稀有密碼子在基因工程中有何影響
(1)E·coli DNA連接酶源於腸桿菌用於連接粘性末端; (2)T4DNA連接酶:源於T4噬菌體用於連接粘性末端平末端連接效率低 (3)熱穩定DNA連接酶(thermostableDNAligase)嗜熱高溫放線菌(Thermoactinomycest
㈧ 密碼子優化
利用不同的細胞表達,對密碼子的偏好性是不同的,只要注意選擇他們最喜歡的密碼子同時避免稀有密碼子即可,密碼子優化原則就是這樣很簡單,但是進行優化要了解大量的知識,不然怎麼判斷不同的細胞到底喜歡哪些密碼子呢,但是又說回來,例如大腸桿菌或靈長類動物,他們對密碼子的偏愛性又是固定的。。。。要注意的點就是密碼子優化之後,要保證表達的產物蛋白是沒有變的,因為密碼子的簡並性,可以很方便的優化
如有幫助,請採納~謝謝
㈨ 急用!一論述題:如何克隆一個功能性基因,如何在原核系統中高效表達
你的題目關鍵是解決兩個問題:一是功能性基因在原核生物中的表達;二是如何高效進行表達。
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1、原核生物只有一種RNA 聚合酶(真核細胞有三種)識別原核細胞的啟動子,催化所有 RNA的合成。
2、原核生物的表達是以操縱子為單位的。操縱子是數個相關的結構基因及其調控區的結合,是一個基因表達的協同單位。調控區主要分為三個部分:操縱基因、啟動子及其他有調控功能的部位。
3、功能性基因一般是真核生物所具有的基因,而真核生物基因基本具有外顯子和內含子等結構。原核基因一般不含有內含子,在原核細胞中缺乏真核細胞的轉錄後加工系統,因此當克隆的含有內含子的真核基因在原核細胞中轉錄成 mRNA 前體後,其中內含子部分不能被切除。
4、原核生物基因的控制主要在轉錄水平。這種控制要比對基因產物的直接控制要慢,對RNA 合成的控制有兩種方式:一是起始控制(啟動子控制),二是終止控制(衰減子控制)。
5、在大腸桿菌(大多工程菌都是使用大腸桿菌)mRNA的核糖體結合位點上,含有一個轉譯起始密碼子及同16S核糖體RNA 3'末端鹼基互補的序列,即 SD 序列,而真核基因則缺乏此序列。因此,真核基因本身的mRNA前端部分不能直接使用,需要進行一定的修飾。
將外源基因在原核細胞中表達,必須考慮表達載體、外源基因的性質、原核細胞的啟動子和 SD 序列、閱讀框架及宿主菌調控系統等基本條件,也就是說必須滿足以下條件:
⑴通過表達載體將外源基因導入宿主菌,並指導宿主菌的酶系統合成外源蛋白;
⑵外源基因不能帶有內含子,因而必須用 cDNA 或全化學合成基因,而不能用基因組 DNA;
⑶必須利用原核細胞的強啟動子和 SD序列等調控元件控制外源基因的表達;
⑷外源基因與表達載體連接後,必須形成正確的開放閱讀框架(open reading frame);
⑸利用宿主細胞的調控系統,調節外源基因的表達,防止外源基因的表達對宿主菌的毒害。
大腸桿菌表達系統是目前應用最廣泛的表達系統,由於待表達的外源基因結構具有多樣性,尤其是真核生物基因的結構與大腸桿菌基因結構之間存在較大的差異,因而在構建表達系統時必須具體情況具體分析。一般來說,高效表達外源基因必須考慮以下基本原則:
①優化表達載體的設計。為了提高外源基因的表達效率,在構建表達載體時對決定轉錄起始的啟動子和決定 mRNA 翻譯的SD序列進行優化。具體方法包括組合強啟動子和強終止子;增加 SD 序列中與核糖體 16S rRNA 互補配對的鹼基因序列,使 SD 序列中6~8 個鹼基與核糖體16S rRNA 的鹼基完全配對;根據待表達外源基因的不同情況調整 SD 序列與起始密碼子 ATG 之間的距離及鹼基的種類;防止核糖體結合位點附近序列轉錄後形成「莖環」二級結構。
②提高稀有密碼子 tRNA 的表達作用。多數密碼子具有簡並性,而不同基因使用密碼子的頻率不相同。大腸桿菌基因對某些密碼子的使用表現了較大的偏愛性,在幾個同義密碼中往往只有一個或兩個被頻繁地使用。同義密碼子使用的頻率與細胞內相應的 tRNA 的豐度呈正相關,稀有密碼子的tRNA在細胞內的豐度很低。在 mRNA的翻譯過程中,往往會由於外源基因中含有過多的稀有密碼子而使細胞內稀有密碼子的 tRNA供不應求,最終使翻譯過程終止或發生移碼突變。此時可通過點突變等方法將外源基因中的稀有密碼子轉換為在受體細胞中高頻出現的同義密碼子。
③提高外源基因 mRNA 的穩定性。大腸桿菌的核酸酶系統能專一性地識別外源 DNA或 RNA並對其進行降解。對於 mRNA 來說,為了保持其在宿主細胞內的穩定性,可採取兩種措施,一是盡可能減少核酸外切酶可能對外源基因 mRNA的降解,二是改變外源基因 mRNA 的結構,使之不易被降解。
④提高外源基因表達產物的穩定性。大腸桿菌中含有多種蛋白水解酶,在外源基因表達產物的誘導下,蛋白水解酶的活性可能會增加。因此,須採用多種措施提高外源蛋白在大腸桿菌細胞內的穩定性。常用的方法包括:將外源基因的表達產物轉運到細胞周質或培養基中;選用某些蛋白水解酶缺陷株作為受體菌;對外源蛋白中水解酶敏感的序列進行修飾或改造;在表達外源蛋白的同時,表達外源蛋白的穩定因子。
⑤優化發酵過程。在發酵罐內工程菌生長到一定的階段後,開始誘導外源基因的表達,誘導的方式包括添加特異性誘導物和改變培養溫度等。使外源基因在特異的時空進行表達不僅有利於細胞的生長代謝,而且能提高表達產物的產率。生物因素的第三方面是提高外源基因表達產物的總量。外源基因表達產物的總量取決於外源基因表達水平和菌體濃度。在保持單個細胞基因表達水平不變的前提下,提高菌體密度可望提高外源蛋白質合成的總量。