1. 活細胞的顯微計數方法及步驟
將細胞樣品與台盼藍染料混合。活細胞排斥染料，而死細胞被染成深藍色。將細胞鋪在血球計數器的玻板上，顯微鏡下進行人工計數。
一、材料
血（球）計數計（改進的Neubauer 型），每次用後洗凈並晾乾。（也可以用其他計數器，只是格子不同。）
血（球）計數計的蓋玻片（可重復使用），每次用後洗凈並晾乾。
含0.4% (W/V) 台盼藍的PBS 。
計數器
懸浮好的細胞（既可以是懸浮生長的細胞，也可以是胰蛋白酶處理的貼壁生長的細胞），確認貼壁生長的細胞已經充分游離成單細胞（見圖1) ，渦旋培養瓶後取代表性樣本。
圖1 a 單層細胞呈扁平狀，對比度較低。
b 當細胞剛剛從基底上剝落時它們仍舊結合在一起。
c 很快當所有的細胞都剝落下來後，大多數細胞都呈單個游離
圖2 使用血球計數計（改進型）進行細胞計數，細胞計數計中央網格的兩側格室都要鋪滿細胞
a 用10 X 的物鏡觀察（總放大倍數為100), 1 mm2 的格子可以完全出現在視野內。每個1 mm2 的格子被分成了25 個小格子。
b. 25 個小格子的每個又被分成了20 個更小的方格，以計數小的或稀少的細胞數。
c. 用1 mm2的小格子的細胞數計算到每毫升細胞數。
移液器、移液頭。
微型離心管。
直立或倒罰的相差顯微鏡，10倍物鏡。
待稀釋無菌培養基。
二、步驟
將蓋玻片平穩地蓋在血球計數計的中間。
取500 μI 細胞培養液到微型離心管中，如果樣品過少就只取100 μI
取50 μI 細胞和50 μI 台盼藍混勻。
用移液管取50 μI 混合液，輕輕地在蓋玻片的兩邊滴上20 μI, 讓液體通過毛細管現象吸到載玻片上面（如果有兩個樣品，可以放置兩個蓋玻片，並小心地分別滴到蓋玻片下，即使只有一個樣品也要把計數器的兩個計數室都填滿） 。
立刻把計數計放到顯微鏡的工作台上，在低倍鏡下固定一個格子計數，只需計數任何一個1 mm2 格子內的細胞數量， 就可以換到高倍鏡下確保視野中有一個完整的方格。低倍鏡下也可以計數，但不容易區分活的和死的細胞。如果使用的是倒置顯微鏡，要降低物鏡以得到足夠的光線。
大致確定格子中的細胞（數2 5 個小格即可），以決定細胞是要稀釋還是濃縮。理想的細胞數量是30~300 個／ mm, 如果過多，就以1:5 或1: 10 稀釋，（例如10 倍稀釋，將步驟2 中50 μI 細胞懸液與450 μI培養基或緩沖液混合，按步驟3 取50 μI 細胞液與50 μI 台盼藍混合） 。
計算1 mm2 格子內的活細胞數量，死細胞會全部被染成藍色，而活細胞不被染色（可能會有藍邊） 。最好是把兩者都數出來，可以計算出活細胞的比例。
計數3 個不同的1 mm2 的格子，得到平均值。
計算出1 ml 中的細胞數目。
平均值X 10 000 X 稀釋倍數＝ 原始樣品中1 ml 的細胞數。
例如
三個格子的細胞數分別為113 、99 和118, 平均為11 0 。
110 X 10 000 = 1.1 X 106
由於細胞和台盼藍是等體積混合，稀釋倍數為2,
2 X 1. 1 X 106 = 2. 2 X 106
所以原液中細胞數目為2.2 X 106 個／ ml 。
計算出原細胞懸液中活細胞的比例
計算方法為： （活細胞總數／細胞總數） X100
三、溫馨提示
1.沒有將懸浮很好的或混合很好的細胞加到計數室內是血球計數氐不能正確計數的主要原因。
2. 如果細胞數小於30, 可以把取出的細胞離心並用小的體積重新懸浮，但是通常不用這樣做。數三個格子求平均值即可。
3. 為了避免同一個細胞數兩次，只計數每個小格子上部和左邊的細胞而不計數右邊和下邊的細胞。每次計數的時候都要遵循同一規則，這樣才能保證每次計數的都一樣。
4.如果每次數的細胞數量差別在20% 以上，說明細胞沒有完全分散，或有成團的現象。
2. 如何對活細胞進行計數
用台盼藍拒染法計數活細胞:
1. 徹底混合細胞懸液,取100礚樣本至一支試管中.
2. 台盼藍染色有兩種方法.一是首先用細胞培養液稀釋細胞樣本,然後用台盼藍溶液(產品號 #07050) 1/2稀釋樣本（細胞和台盼藍的稀釋比為1:1）.或者直接用台盼藍溶液稀釋樣本.
例如：1/40稀釋樣本
加入50礚 細胞懸液至950礚 IMDM+2% FBS (1/20 稀釋),混合,然後取100礚稀釋的細胞懸液加入100礚台盼藍溶液中(終稀釋度為1/40).或取20礚細胞懸液加入780礚台盼藍溶液中(終稀釋度為1/40).
3. 渦懸振盪,混合稀釋的細胞樣本.
4. 血細胞計數器的准備：首先用酒精清潔其小室和蓋玻片,然後用脫脂綿擦乾.
5. 仔細的將蓋玻片覆蓋兩個小室.
6. 用微量移液器或毛細管吸取稀釋的樣本.
7. 用微量移液器或毛細管將樣本充滿兩個小室.不要過滿或不足.
8. 計數4個大方格中細胞核的總數(1x1x0.1mm)或>100個細胞.分別死細胞和活細胞.死細胞染成藍色的死細胞(因為細胞完整性破壞,細胞吸收台盼藍),活細胞透明有折光（未染色）.
9. 活細胞計數按以下方法計算：
每個方格中活細胞總數平均值x稀釋倍數x104= 活細胞數/mL
3. 到底怎樣計數細胞呢稀釋倍數怎麼算
一般來說，細胞的計數方法是：細胞數/mL=4個大格細胞總數/4×10000×稀釋倍
數
操作步驟：
1.取10ul細胞懸液與10ul台盼蘭混合均勻於1.5ml離心管中。
2.蓋上蓋玻片，取10ul混合液自血球計數盤上方加入，於10倍生物顯微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞被染成藍色。
3.分別計數四個大方格，得到細胞總數，再除以4，乘以稀釋倍數（本實驗為2），最後乘以104，即為每ml細胞懸液中細胞數。若細胞位於線上，只計上線與左線（計上不計下，計左不計右）。
註：
1.細胞數/ml＝4大格細胞總數×稀釋倍數×104/4；每一大格的體積為＝0.1cm×0.1cm×0.01cm＝10-4ml
2.計數板計數時，最適細胞濃度為5～10×105個/ml，此范圍外計數誤差偏大。
3.高濃度細胞懸液，可取出部分作稀釋或連續稀釋後計數。
例
活細胞數/方格：55，62，49，59；死細胞數/方格：5，3，4，6；細胞總數＝243
平均細胞數/方格＝60.75；稀釋倍數＝2；
細胞數/ml：60.75×104×2＝1.22×106；
細胞數/flask（10ml）：1.22×106×10ml＝12.2×106
存活率：225/243﹦92.6%