『壹』 放置離體沒用的標本放冰箱要幾度
-80度保存，組織要切小塊，浸泡~提RNA，無論長短，可以存放10年都沒問題.
標本採集是我們實驗一個重要的前期工作，但是大多數研究人員對標本採集以及保藏的步驟及相關注意事項知之甚少。簽署術中標本留取活檢協議書，同時與臨床科室、手術室密切聯系，並由臨床醫生填寫標本入庫登記表，事先跟病理科醫生協商，在組織標本足夠大，能確保病理檢查的前提下，切取少許組織進庫保存，遇到小組織標本要果斷放棄收集。在標本離體後應在最短時間內(<30
min) 更換器具切取包括腫瘤、瘤旁、正常組織組織標本，成直徑約0.2 cm～0.5
cm的組織塊，各取2塊～4塊，分別裝入已編號的帶有橡皮墊圈的滅菌凍存管中，旋緊蓋子後放入液氮轉移罐，防止冷凍後爆管。
『貳』 核酸樣本要求在多少度保存運輸
一般冰箱內溫度為0℃-12℃，冷凍室溫度為5℃-18℃。標本攜帶者和接受者應對病毒分離和核酸檢測標本進行雙簽。24小時內可檢測的標本可保存在4℃下。24小時內無法檢測的標本應保存在-70℃或以下(如無-70℃保存條件，則臨時保存在-20℃冰箱中)，並設置專門的庫房或櫃台單獨存放標本，避免標本在運輸過程中反復凍融。
標本採集4小時後，應在室溫下保存不超過4小時，2-4小時內送至實驗室。應設立專門的庫或專櫃，單獨保存樣品。一般核酸檢測的樣本需要低溫保存，短時間內就會送檢，最多不超過4小時。所以室溫下放18個小時應該是沒用的。
標本採集後室溫保存不超過4小時，並在2~4小時內送至實驗室，避免標本運輸過程中反復凍融。
如需長途運輸標本，應採用乾冰等冷藏方式保存，並嚴格按照相關規定對包裝和運輸標本的接受者進行個人防護，按照采樣人員的防護裝備執行。
標本接收人員的個人防護應根據采樣器的防護裝備進行。核酸試劑應保存在核酸試劑低溫冰箱中，特別是24小時內不能用完的試劑必須保存在-20℃以下的低溫冰箱中。
『叄』 10X 單細胞基因表達樣本制備指南
單細胞轉錄組學是闡明復雜生物系統的一種強大工具，讓您能夠逐個細胞地研究基因表達動態。通過生成細胞群體的單細胞圖譜，單細胞RNA測序(scRNAseq)能夠解析復雜樣本中不同類型細胞之間的特定差異。單細胞基因表達譜分析帶來了疾病發展過程中有關細胞進程的重要見解 。scRNA-seq 技術的進步讓研究人員能夠獲取之前經常會被大量（Bulk）細胞的RNA-seq方法所掩蓋的關鍵數據，如罕見或新的細胞類型，從而在單細胞水平上探索真正的基因表達多樣性(圖1)。
然而，為了充分利用這種革命性的技術，必須妥善地制備單細胞樣本。本文對制備單細胞樣本的建議進行了概括，這些樣本可用於10x Genomics的單細胞基因表達（Single Cell Gene Expression）或免疫分析（Immune Profiling）解決方案。
scRNA-seq樣本制備方案
• 細胞解離操作的技巧
• 移液技術和槍頭選擇
• 細胞清洗與過濾
• 細胞計數和活力評估
• 樣本制備後的保存
首先，建議採用無菌的樣品處理，包括使用不含核酸酶的試劑和耗材。為減少對細胞的損傷，移液和離心應保持在最低程度。在給定的離心速度，時間和溫度下，細胞濃度和大小直接影響制備的效率。緊密堆積的細胞沉澱可能需要額外的操作，但也因此可能會通過剪切效應損害細胞。當然，在這個時候，離心條件需要調整。
此外，在進行細胞清洗和重懸過程中，使用足夠的容積也是避免高濃度導致細胞集聚和結塊的途徑。懸液需要通過合適的細胞過濾器進行篩選來去除結塊和碎片。這里推薦的細胞清洗和重懸液為包含牛血清白蛋白的磷酸鹽（不含有鈣鎂離子）。原代細胞，幹細胞和其他一些敏感細胞在清洗和重懸過程中需要更換緩沖液以確保活性。細胞團導致自動細胞計數器低估了單細胞的有效濃度。因此，懸浮液應在制備後盡快處理，最好在30分鍾內。
在單細胞准備過程中應盡量減少細胞集聚，死細胞，無細胞的核酸和反轉錄抑制劑的存在。為了最大限度地減少這些污染，同時最大化不同細胞類型的純度和無偏差恢復，可能需要條件優化（例如，調整洗滌步驟的數量，洗滌溶液的組成，離心條件和過濾器類型）。
為了獲得活力高的細胞並 盡量避免細胞死亡和裂解 ，您需要根據特定的樣本類型來優化細胞解離的操作。死細胞會裂解，並向周圍環境釋放RNA；這種游離RNA會造成檢測的背景噪音，並影響單細胞數據的質量。若細胞得到妥善處理，將會對測定產生直接影響，這些測定決定了上樣到系統的細胞數量以及回收的細胞數量。遵循下面的指南可提高細胞計數的准確性，並最大限度減少樣本之間的差異。
充分了解對於 樣本類型 的限制和要求將有助於產生更加可靠的數據。許多現有的樣本制備方案可以解決這些問題，不過或許需要根據您特定的樣本類型進行調整。例如，懸浮細胞系、磁珠富集的細胞和流式分選的細胞已經處於懸浮狀態，只需要進行清洗和計數，即可用於Chromium單細胞基因表達或免疫分析解決方案。然而，在處理組織時，必須在第一次文庫制備之前很好地優化解離方案，以確保達到最佳質量。我們提供了多個示範方案，指導您優化樣本制備.
另一個考慮因素是 不同類型細胞 中的起始RNA含量各異，而RNA起始量的准確測定將影響流程中的一些關鍵決策，如文庫制備時的PCR循環數。例如，人外周血單核細胞（PBMC）中的RNA很少，每個細胞只含有0.75 pg，而HCC38細胞系則富含RNA，每個細胞可達21.6 pg（表1）。
在解離組織或處理懸浮狀態的細胞時， 移液技術 是至關重要的。例如，當細胞靜置在管中時，它們會開始沉降。從溶液的頂部或底部吸取時，吸到的細胞數量可能有很大差異，尤其是在細胞快速沉降時。因此，在吸取前一刻應當通過移液器 充分而輕柔地混合細胞懸液 ，然後每次從管的 中部吸取 ，通常低於溶液的中間標記。
此外，移液時必須 輕柔 地處理細胞。如處理手法比較劇烈，即便採用大口徑的移液吸頭，也會對樣本質量造成負面影響。表2比較了在HEK293T細胞上開展的四個不同的細胞混合實驗得到的單細胞數據的關鍵指標。劇烈的移液混合和渦旋振盪都會導致細胞過早裂解，從而在周圍環境中產生高水平的RNA，引起系統中的背景噪音，並最終降低細胞reads數的比例（以藍色高亮 顯示 ） 。 同樣地， 每個細胞的基因數中位值也會因劇烈地細胞處理而減少（表2）。因此，細胞懸液應該通過 大口徑的移液吸頭來輕柔混合 。這將有助於獲得背景更干凈的數據，增加文庫的復雜性（即增加每個細胞的基因數中位值），並提高細胞reads數的比例。
在處理懸浮細胞系、解離組織或大量細胞時，我們強烈建議您採用 徹底的清洗方案 ，這將影響上樣至Chromium Controller後的細胞回收。具體方案可根據樣本類型以及scRNA-seq方法而調整。我們提供的scRNA-seq清洗方案需要用到含0.04% BSA的PBS溶液，用於細胞的清洗和重懸。
大的細胞團塊或碎片會增加微流體晶元的堵塞風險，並且干擾准確的細胞計數，從而影響細胞回收，特別是在使用自動細胞計數器時。為了避免這一問題，我們建議您將細胞懸液上樣到微流體晶元之前，使用孔徑為30-40 μm的細胞過濾網。很多過濾網已成功通過測試，可用於我們單細胞基因表達和免疫分析解決方案中的樣本。
值得注意的是，每次過濾都會導致細胞懸液體積的減少以及細胞濃度的變化。如果需要過濾，您 應當在過濾完成後對單細胞懸液進行重新計數。
為從懸液中獲得單細胞，樣本需要通過梯度離心。實體組織需要在一開始進行機械分離或者酶消化處理。首先，組織需要通過物理切割或者刀片切碎，然後通過酶消化來分離細胞。特定的組織消化酶及消化時間見下表。
酶種類包括Accutase, elastase，collagenases，商業化的酶試劑包括TrypLE Express，Liberase Blendzyme 3。細胞裂解後可能會引起細胞聚集，可通過用DNase I處理來降低集聚。最後，懸液通過過濾器進行過濾以達到純化目的。
值得注意的是，樣本准備過程可能會引起細胞中基因表達模式的改變，特別是一些脅迫相關基因的激活。此外，一些敏感的細胞亞型可能在此過程中受到傷害。所以， 樣本准備過程越短越好 。相反，如果消化時間太短，可能細胞分離不完全，需要在後續單細胞分析過程中排除掉這些緊密相連的細胞。
為避免細胞組成背景，可以通過破壞細胞膜，分離細胞核來實現。對細胞核RNA進行測序，也是一種分類細胞類型的好方法，但可能會對每個細胞的整體理解會產生偏差。單細胞核RNA測序已經不同的神經細胞研究中有所運用，因為成人神經組織細胞是高度內聯的，無法有效分離。
在評估樣本質量時，您需要在細胞清洗和過濾之後測定細胞活力，這一點至關重要。測定細胞活力有許多種方法，但我們發現 台盼藍排除法 在鑒定活細胞與死細胞的比例時效果很好。最終細胞計數的准確性以及目標回收量和實際回收量之間的一致性，取決於我們了解樣本中有多少個細胞。一旦過濾和清洗完成，可採用細胞計數設備（如血球計數器或自動細胞計數儀）進行定量。這些設備不僅能提供准確的細胞計數，還能計算出向微流體晶元上樣適量細胞所需的細胞懸液體積。
響最終細胞計數准確性的另一個重要因素是 細胞儲存液的濃度 。我們發現，濃度介於700-1,200個細胞/μL的細胞儲存液是最佳的，可以讓回收細胞的數量達到目標值（圖2）。細胞懸液的濃度一旦超出這個最佳范圍，將會導致細胞計數不可靠。如果樣品在這個范圍以外，我們建議相應地調整細胞儲存液的濃度。
高比例的死細胞可能會影響目標細胞的回收量，因此對於死細胞比例較高（>30%）的樣本，我們建議您參考從單細胞懸液中去除死細胞的示範方案。此方案概括了一些最佳做法，能夠降低單細胞懸液中的死細胞比例。
為了最大限度地減少轉錄組的變化，在對細胞進行清洗和計數後，單細胞懸液應當保存於冰上，直至用於後續的上機和文庫制備步驟。在理想狀況下，一旦制備好樣本，應當在30分鍾內將其用於下游步驟。
然而 ，您還有必要了解各類細胞的不同性質，因為這可能會影響細胞應在冰上保存的時間，以及它們在制備後多久便應當被盡快使用。例如，有些細胞（如PBMC）如果在冰上放置一段時間，它們就開始形成團塊。這些團塊很難解離，增加了堵塞的風險，而且每個團塊被當成單細胞計數，又降低了細胞計數的准確性。此外，有些細胞更加粘稠，形成團塊的速度更快。對於這些細胞，必須盡量減少制備和使用之間的時間差。
大部分的scRNA-seq都是用新鮮分離細胞進行實驗。但是，由於研究和臨床實驗特殊性，缺少足夠的所需基礎設施或專用設備，而使得對樣本進行快速處理顯得非常困難。另外，有些樣本需要在多個不同的時間點進行收集，同時為避免技術誤差需要樣本在同一時間進行單細胞實驗過程。因此，有效的樣本保存方案是實現樣本采樣位置和時間與下游實驗過程分開的解決方法。
有研究表明，當樣本保存在-80℃或者液氮一年，隨後解凍，來自細胞系和原代樣本的冷凍保存的細胞顯示出與新鮮制備的細胞類似的RNA分子的完整性，基因表達譜也沒有明顯改變。當然，應盡量避免細胞多次凍融。同樣，甲醇固定已被確立為基於液滴的單細胞方法的替代性方案，也可避免由於樣本處理時間延長而引發的基因表達變異。重要的是，凍存和固定方法都可以實現樣本的儲存和運輸，擴大scRNA-seq方法的應用范圍，例如，擴展到臨床領域。然而，這兩種方法都顯示出細胞類型組成的潛在偏差，強烈建議徹底評估未經測試的新細胞類型的保存方法前不易直接使用。對於先前已保存的樣品，例如速凍樣品，細胞核測序是唯一的scRNA-seq解決方案。這是因為與冷凍保存不同，快速冷凍過程中冰晶的形成破壞了外部細胞膜，但是細胞核保持完整。但是，這也應該優先對RNA完整性進行初始估計，以避免與樣品質量相關的偏差。
Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies
來自《Nature Protocols》的單細胞轉錄組研究樣本准備指南
https://assets.ctfassets.net/an68im79xiti/4cFfVJH95mgYeSIcEAUE6Y//CG00054__-_CultCells_RevB.pdf
https://assets.ctfassets.net/an68im79xiti/2Sd6Fyx0YMqCC4m2uocS2u//CG000126_Guidelines_for_Optimal_Sample_Prep_Flow_Chart_RevA.pdf
『肆』 標本盒菌株在異地運輸時必須堅持什麼
要堅持保溫，快速，密閉，避光，安全。
普通菌種最適溫度為4度，對於肺炎鏈球菌等特別難保存的需要負20度保存。標本在輸運送過程中，應防止標本容器的破碎和標本的丟失，注意容器的密閉、避光（如陽光直射下血中膽紅素會分解），同時應注意生物安全，防止意外發生。常見檢驗項目標本轉送要求：
1、采樣後須立即送檢的常規項目 血氨、血沉、血氣分析、酸性磷酸酶、乳酸以及各種細菌培養，特別是厭氧菌培養。
2、采樣後0.5小時內送檢的常規項目 血糖、電解質、血液細胞學、凝血試驗、體液細胞學、塗片找細菌、真菌等。
3、采樣後1~2小時內送檢的常規項目 各種蛋白質類、色素類、激素類、脂類、酶類、抗原、抗體測定等。
4、採集後立即冰凍的檢測項目 需要對標本冰凍的檢測物質有促腎上腺皮質激素（ACTH）、乙醯膽鹼酯酶（ACE）、丙酮、血氨、游離脂肪酸、乳酸、丙酮酸鹽和腎素。
5、需避光的檢測項目 感光物質需避光以保持穩定性，如膽紅素、β-胡羅卜素和紅細胞原卟啉等，可以用鋁制蓋子罩在試管外壁光。
標本採集後立即送檢，若有延遲也應在2小時內送到實驗室，否則會影響病原菌的檢出，一般性的細菌培養標本若需延遲送檢時，應置於4度冰箱保存，且不能超過24小時。臨床標本最佳運送時間取決於標本的量，少量液體（小於1ml）或組織（小於1cm3）應在15~30分鍾內送到實驗室，較多量的標本置於運送培養基中可放12~24小時，厭氧培養標本原則上是床邊接種，如延遲送檢，需保存在厭氧運送培養基中，室溫保存，不得超過24小時。
『伍』 用於提取RNA新鮮組織如何保存
市場上有一種非冰型RNA樣品保存液.有些公司叫RNAwait,或者還有別的名稱,你可以了解一下.
很多公司都有的.
非凍型組織細胞RNA保存液（RNAwait）是一種在較高溫度下保存動物組織及細胞RNA樣品的非凍型無毒溶液，它能迅速滲入細胞內，通過高效抑制RNase的活性而保存RNA的完整性。
產品特點
1．操作簡單，將組織剪薄浸沒在RNAWAIT中即可使其RNA不被降解。
2．替代液氮，使樣品的保存不需液氮，乾冰或-80℃冰箱，尤其適用於臨床和野外樣品的快速和大規模採集。
3．RNA完整，因RNAwait能迅速抑制組織中RNA酶的活性，故從中提取的RNA的質量跟液氮保存的樣品相比不相上下。
4．方便運輸，處理過的樣品能在25℃保存一周，使樣品郵寄和運輸變得容易和便宜，有利學術合作和交流。
5．反復凍融，經RNAwait處理的樣品可反復凍融20次，其間可對樣品進行各種處理而不影響最終提取的RNA的質量。
6．結果准確，RNAwait進入細胞十分快速，基因表達在發生應急改變前就得以鎖定，故RNA分析更能反映取樣時的真實情況。
7．可比性強，RNAwait能減少大規模樣品處理中的誤差，增加各次實驗數據間的可比性，對大規模基因表達譜的分析尤其有用。
8．兼容性廣，處理過的樣品可以使用TRIzol 等試劑提取其RNA，樣品還可直接用於組織切片，免疫學和流式細胞分析而不影響RNA的質量。
『陸』 微生物檢驗標本採集和運送原則
采樣時機
抗生素使用前(停用抗生素3至5天或下次用葯前)采樣
采樣方法
採集無菌部位的標本應嚴格無菌操作，非無菌部位盡量減少正常菌群的污染，采樣量足。
采樣容器
專用的無菌，防滲漏，有蓋，無酸、鹼、防腐劑及消毒劑污染。
送檢
盡快送檢，一般不超過2小時。
若不能及時送檢可於4-8℃保存，但對可疑淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌等對外界環境敏感的苛養菌感染的患者標本應室溫保存。
當標本量小於1ml時應於15～30分鍾內送檢，防止揮發和乾燥。
微生物檢查的標本採集和運送原則
1.發現感染應及時採集微生物標本作病原學檢查。
2.盡量在抗菌葯物使用前，或停葯3至5天後採集標本，如不能停用抗菌葯物，應於下次抗菌葯物應用前採集。應在感染的急性期或傷口局部治療前採集標本。
3.選擇正確的解剖部位，並以適當的技術、方法與容器收集足量的標本。
4.采樣時應嚴格執行無菌操作，將污染可能降至最低。
5.收集真正感染的病灶處的標本，且避免鄰近區域常居菌群的污染。
6.採用專用無菌容器收集標本。容器須滅菌處理，防止滲漏，但不得使用消毒劑。標本中不可添加防腐劑。
7.采樣後應立即送檢，最好在2h內。如不能及時送檢，應將標本置於適當的儲存環境待送，但不超過24小時。對可疑淋病奈瑟菌、腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌等對外界環境敏感的苛養菌感染的患者標本應室溫保存。當標本量小於1ml時應於15～30分鍾內送檢，防止揮發和乾燥。
8.盡量不要以一般棉花拭子收集標本，應使用專用的纖維拭子。
9.每份標本都應貼上標簽並標明必要信息，在檢驗申請單上填寫足夠的有關臨床資料。(要標明病區、病人姓名、感染狀況、近期抗菌葯物使用情況、標本來源、檢驗目的、採集部位、採集及送檢時間等)
10.同一天同一檢測目的、相同標本(血液標本除外)一般只需送檢一次(份)。塗片檢查最好和細菌培養同時做!
拓展：
1.糖類的分解：細菌分泌胞外酶，將菌體外的多糖分解成單糖(葡萄糖)後再吸收。各種細菌將多糖分解為單糖，進而轉化為丙酮酸，這一過程是一致的。丙酮酸的利用，需氧菌和厭氧菌則不相同。需氧菌將丙酮酸經三羧酸循環徹底分解成CO2和水。厭氧菌則發酵丙酮酸，產生各種酸類(如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、琥珀酸等)、醛類(如乙醛)、醇類(如乙醇、乙酸甲基甲醇、異丙醇、丁醇等)、酮類(如丙酮)。不同細菌具有不同的酶，對糖類的分解能力和代謝產物也不同，藉此可以鑒別細菌。
2.蛋白質的分解：蛋白質分子在細菌分泌的蛋白質水解酶的作用下，在肽鍵處斷裂，生成多肽和二肽。多肽和二肽在肽酶的作用下水解，生成各種氨基酸。二肽和氨基酸可被細菌吸收，氨基酸在體內脫氨基酶的作用下，經脫氨基作用生成氨。不同種細菌在不同的條件下所進行的脫氨基作用的方式(氧化脫氨基、水解脫氨基、還原脫氨基)及代謝產物也不同。可藉此鑒別細菌。如有些細菌能使色氨酸氧化脫氨基，生成吲哚、C02和H20.細菌還可以用脫羧酶使氨基酸脫羧，生成胺類(如組胺)和C02.
3.細菌對其他物質的分解：細菌除能分解糖和蛋白質外，對一些有機物和無機物也可分解利用。各種細菌產生的.酶不同，其代謝的基質不同，代謝的產物也不一樣，故可用於鑒別細菌。
(1)對其他有機物的分解：如變形桿菌具有尿素酶，可以水解尿素，產生氨。乙型副傷寒沙門菌和變形桿菌都具有脫硫氫基作用，使含硫氨基酸(胱氨酸)分解成氨和H2S.
(2)對其他無機物的分解：產氣腸桿菌分解檸檬酸鹽生成碳酸鹽，並分解培養基中的銨鹽生成氨。細菌還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，氨和氮氣的作用，稱為硝酸鹽還原作用。
4.細菌合成代謝產物的意義
(1)熱原質：大多數為革蘭陰性菌合成的菌體脂多糖。注入人體或動物體內能引起發熱反應，故稱熱原質。
(2)毒素和侵襲性酶：細菌產生毒素，包括內毒素和外毒素。內毒素為草蘭陰性菌的脂多糖。外毒素是革蘭陽性菌產生的蛋白質，毒性強且有高度的選擇性。有些細菌還能產生具有侵襲性的酶，如卵磷脂酶、透明質酸酶等。毒素和侵襲襲性酶在細菌致病性中甚為重要。
(3)色素：有水溶性色素(銅綠假單胞菌的色素)和脂溶性色素(金黃色葡萄球菌的色素)。不同細菌產生不同的色素，在鑒別細菌上有一定意義。
(4)抗生素：是由某些微生物代謝過程中產生的、能抑制或殺死另一些微生物和癌細胞的微量生物活性物質。
(5)細菌素：某些細菌菌株產生的一類具有抗菌作用的蛋白質，細菌素作用范圍狹窄，僅對與產生該種細菌素的細菌有近緣關系的細菌才能起作用，如大腸菌素、綠膿菌素、變形菌素和弧菌素等。
『柒』 存放臨床樣本一定要獨立的房間嗎
存放臨床樣本一定要獨立的房間。根據查詢相關公開信息，存放臨床樣本對溫度是有要求的，常在低溫下保存，就要有單獨的房間進行存放，確保樣本不會損壞。