1. 蛋白质质谱分析具体流程
质谱技术在蛋白质组学中的应用
王海龙杨静祁振国岳秀兰
(包头医学院生物化学与分子生物学教研室，内蒙古包头014010；赤峰市第一医院’)
中图分类号(}so3 文献标识码A 文章编号1006—740X(2006)02—0231一o3
蛋白质组学是后基因组时代的一个新领域，它通
过在蛋白质水平上对细胞或机体基因表达的整体蛋白
质的定量研究，来揭示生命的过程和解释基因表达控
制的机理⋯ 。蛋白质组学分为表达蛋白质组学(Ex·
pression Proteomies)和细胞图谱蛋白质组学(Cell Map
Pmteomies)，前者指细胞和组织表达的蛋白质的定量
图谱，它依赖二维凝胶电泳图谱和图像分析，它能在整
体蛋白质水平上研究细胞的通路，以及疾病、药物和其
它生物刺激所引起的紊乱，因此它可能发现疾病标志
和阐明生物通路；后者是指通过纯化细胞器或蛋白质
复合物，用质谱鉴定蛋白质组分，确定蛋白质和蛋白质
相互作用的亚细胞位置 】。9O年代以来随着人类基
因组计划的实施，引发了生物信息学(Bioinformaties)
的发展，使蛋白质分析发生了革命性的变化。现在将
高分辨2一维电泳、高灵敏度的生物质谱和快速增长
的蛋白质和DNA数据库三者结合起来，为高通量的蛋
白质组学(High throughout Proteomies)铺平了道路 。
这里主要介绍质谱技术在蛋白质组学中的应用。
收稿日期：2006-03-02
作者简介：王海龙(1951一)，男。大学，副教授。
l 质谱技术的发展历史
1．1 质谱的开发历史要追溯到2O世纪初，Thomson
创制的抛物线质谱装置，1919年Aston制成了第一台
速度聚焦型质谱仪，成为了质谱发展史上的里程碑。
最初的质谱仪主要用来测定元素或同位素的原子量，
随着离子光学理论的发展，质谱仪不断改进，其应用范
围也在不断扩大，到2O世纪5O年代后期已广泛地应
用于无机化合物和有机化合物的测定。现今质谱分析
的足迹已遍布各个学科的技术领域，在固体物理、冶
金、电子、航天、原子能、地球和宇宙化学、生物化学及
生命科学等领域均有着广阔的应用。质谱技术在生命
科学领域的应用更为质谱的发展注入了新的活力，形
成了独特的生物质谱技术。
1．2 基本原理质谱(Mass Spectrometry)是带电原
子、分子或分子碎片按质量的大小顺序排列的图像。
质谱仪是一类能使物质离化成离子并通过适当的电
场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与
否实现质量比分离，并检测强度后进行物质分析的仪
器。质谱仪主要由分析系统、电学系统和真空系统组
成 。
用于分析的样品分子在离子源中离化成具有不同
质量的单电荷分子和碎片离子，这些单电荷离子在加
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232 包头医学院学报 第22卷
速电场中获得相同动能并形成一束离子，进入由电场
和磁场组成的分析器，离子束中速度较慢的离子通过
电场后偏转大，速度快的偏转小；在磁场中离子发生角
速度矢量相反的偏转，即速度慢的离子依然偏转大，速
度快的偏转小；当两个场的偏转作用彼此补偿时，它们
的轨道便相交于一点。与此同时，在磁场中还能发生
质量的分离，这样就使具有同一质量比而速度不同的
离子聚焦在同一点上，不同质量比的离子聚焦在不同
的点上，其焦面接近于平面，在此处用检测系统进行检
测即可得到不同质量比的谱线，即质谱。通过质谱分
析，我们可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中
同位素构成和分子结构等多方面的信息 J。
2 质谱技术种类
2．1 电喷雾质谱技术(Electrospray ionization Mass
Spectrometry，ESI—MS) 是在毛细管的出口处施加一
高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化
成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强
度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷
的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进
入气相⋯ 。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子
而不是碎片离子，使质量电荷比降低到多数质量分析
仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分
析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电
荷数算出。电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多
种分离技术联合使用 j。
2．2 基质辅助激光解吸附质谱技术(Matrix Assisted
Laser Desorption／Ionization，MALDI) 基本原理是将
分析物分散在基质分子中并形成晶体，当用激光照射
晶体时由于基质分子经辐射所吸收的能量，导致能量
蓄积并迅速产热，从而使基质晶体升华，致使基质和分
析物膨胀并进入气相。MALDI所产生的质谱图多为
单电荷离子，因而质谱图中的离子与多肽和蛋白质的
质量有一一对应关系。MALDI产生的离子常用飞行
时间检测器来检测，理论上讲，只要飞行管的长度足
够，检测器可检测分子的质量数是没有上限的，因此质
谱很合适对蛋白质、多肽、核酸和多糖等大分子的研
究。
2．3 快原子轰击质谱技术(Fast Atom Bomebardment
Mass Spectrometry，FABMS) 一种软电离技术，是用快
速隋性原子射击存在于底物中的样品，使样品离子溅
出进入分析器，这种软电离技术适于极性强、热不稳定
的化合物的分析，特别适于多肽和蛋白质的分析研究。
FABMS只能提供有关离子的精确质量，从而可以确定
样品的元素组成和分子式。而FABMS—MS串联技术
的应用可以提供样品较为详细的分子结构信息，从而
使其在生物医学分析中迅速发展起来 ]。
2．4 同位素质谱技术是一种开发和应用比较早的
技术，被广泛地应用于各个领域，但它在医学领域的应
用只是近近几年的事。由于某些病原菌具有分解特定
化合物的能力，该化合物又易于用同位素标示，人们就
想到用同位素质谱的方法检测其代谢物中同位素的含
量以达到检测该病原菌的目的，同时也为同位素质谱
在医学领域的应用开辟了一条思路。
3 电泳分离后凝胶上蛋白质的质谱鉴定
电泳分离后凝胶上的蛋白质，先用适当的蛋白内
切酶酶切成肽段，再用质谱鉴定。现有四种制样方法：
3．1 凝胶内酶切凝胶内酶切的灵敏度高，是当前广
泛采用的样品制备方法。最常用的蛋白内切酶是胰蛋
白酶。它在蛋白质主链精氨酸和赖氨酸的C一端进行
切割。文献中有多种凝胶内酶切的方法，这里介绍改
进后的Wilm的方法。
将电泳后凝胶上的蛋白质斑点以最小的体积切
下，并将凝胶块切成约lmm 小颗粒，转入小离心管
内，加入约5O 的lOOmmol／L碳酸氢铵溶液洗胶粒
5min，弃去碳酸氢铵液，加入50pJ乙腈使凝胶脱水1O
一15min。若胶粒未完全脱水再用乙腈脱水～次，弃去
乙腈液。将离心管置入真空离心蒸发浓缩器内，微加
热15rain使胶粒完全干燥。将50pJ新鲜配制的
10mmoVL DTY韵100mmol／L碳酸氢铵溶液加入离心
管内，使胶粒水化。在56℃加热30rain还原样品，弃
去DTr溶液，加入乙腈放置15min，再在Speed Vac微
加热干燥15rain，加入5O l 55mmol／L碘乙酰胺的
100mmol／L碳酸氢铵溶液，烷基化半胱氨酸残基上的
巯基。室温暗室中放置20 min，弃去上清夜，加入
50pJ乙腈放置15min，在Speed Vac内干燥。加入2O l
胰蛋白酶溶液在4℃放置45—60min使胶粒再水化，
加入1O一2o 碳酸氢铵溶液覆盖胶粒，37cI=保温1小
时后，放置过夜，所得溶液供质谱分析用。
3．2 电洗脱后在溶液中酶解 电洗脱是电泳后从凝
胶上回收蛋白质的经典方法。通常蛋白质量多于0．
O01 mmol。将含SDS的凝胶与MALDI TOF MS分析结
合，可分析亚mmol的蛋白质。Schuh macher等用无
SDS pH2．5的乙酸铵作洗脱缓冲液，电洗脱系统的极
性相反，蛋白质SDS复合物在原位解离，游离的蛋白
质迁移至阴极，用标准蛋白样品实验，回收率达25％
～ 56％ [引
。
3．3 膜上酶切膜上酶切的方法已不常用于质谱分
析，因为它的灵敏度低于凝胶内酶切。电转移时不是
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第2期 王海龙，等．质谱技术在蛋白质组学中的应用 233
所有的蛋白质都能有效转移，而且在印迹过程中蛋白
质可能丢失。另外从PVDF膜上提取酶切后多肽时效
率不高，提取时加Triton 100可以增加多肽的提取效
率，但去污剂干扰质谱鉴定 J。
3．4 印迹过程中酶切 1999年Bins等报道将固定有
胰蛋白酶的膜，置于凝胶和PVDF膜之间在印迹过程
中使蛋白质样品发生酶切，为了蛋白质完全酶切，印迹
过程需要特殊设计。印迹后的膜用基体溶液浸透后可
用MALDI TOF MS直接分析。该法的主要特点是印迹
过程中平行进行酶切，其灵敏度不如标准方法 J。
4 用肽质量指纹谱鉴定蛋白质
蛋白质组学中最有意义的突破是用生物质谱鉴定
电泳后凝胶上的蛋白质。质谱技术已取代了生物化学
中经典的Edman降解技术¨。。，这是由于质谱技术能
进行高通量的分析，能分析蛋白质混合物，而且灵敏。
肽质量指纹谱方法最初由Henzel及其同事提
出¨ ，很快成为高通量蛋白质鉴定的选用方法。分析
时用MALDI TOF MS测定凝胶内酶切后多肽混合物的
质量，获得肽质量指纹图谱。蛋白质酶切后生成多肽
混合物，可以在蛋白质序列数据库内进行理论预测，并
对质谱实测多肽混合物与理论预测的数据进行比较，
质谱实测到足够肽段的质量与数据库中一个蛋白质理
论预测肽段质量匹配，蛋白质可明确鉴定_1 。
随着科学技术的进步，质谱也得到了快速发展，特
别是与生物技术的结合，开创了质谱应用的新领域。
质谱已成为生命科学研究中非常重要的工具。其研究
成果也将大大推动人类基因组的研究，并将使人类对
生命的本质，其发生发展过程的认识达到一个前所未
有新高度。
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2. 蛋白质组学数据分析笔记说明
之前本来打算根据自己对蛋白质组学数据分析的经验和理解写一系列相关教程出来供复习参考，没想到在网上查到别人已经做过了，而且笔记相当全面，从样本处理到质谱仪原理再到数据分析等等都有提及，虽然是2016-2017年的课程，但内容并未过时，对我自己也大有益处。虽然其中一些内容有重复，但我也不想再进行整理了。因为笔记链接只有微信稿，担心后期会失效，所以这里只是简单地拷贝过来，以供复习之用。
1. 蛋白质组学研究方法概述（上）
1. 蛋白质组学研究方法概述（下）
2. 蛋白质组学样品前处理（1）
2. 蛋白质组学样品前处理（2）
2. 蛋白质组学样品前处理（3）
2. 蛋白质组学样品前处理（4）
3. 蛋白质谱的原理及使用（1）
3. 蛋白质谱的原理及使用（2）
3. 蛋白质谱的原理及使用（3）
3. 蛋白质谱的原理及使用（4）
4. 蛋白质组学数据分析基础（1）
4. 蛋白质组学数据分析基础（2）
4. 蛋白质组学数据分析基础（3）
库鑫
博士，2007年毕业于华中科技大学同济医学院，获学士学位。同年9月被保送至中科院上海药物研究所并于2010年取得硕士学位。2010年10月至2014年6月在德国慕尼黑工业大学（Technische Universität München）生物分析与蛋白质组学研究所（Prof. Bernhard Kuster）攻读博士学位，专业方向为基于串联质谱的蛋白质组学在肿瘤药物研究中的应用。库鑫在博士期间发展了基于定量质谱的化学蛋白组学方法用于近生理条件下激酶小分子药物脱靶效应的研究，相关结果发表于J Prot Res, J Prot等杂志上。现任职于上海交通大学系统生物医学研究院，研究方向：肿瘤相关生物标志物的发现和蛋白质糖基化修饰的研究。
刘晓慧
博士，高级工程师，复旦大学化学系/生物医学研究院 。 蛋白质组学与系统生物学实验室，2003年毕业于湖南师范大学 获理学学士学位，2006年毕业于湖南师范大学 获生物化学与分子生物学硕士学位，2014年毕业于复旦大学，获化学生物学博士学位。2006年至今，工作于复旦大学化学系，从事基于生物质谱的蛋白质和多肽定量方法的应用和开发，熟悉iTRAQ,MRM,MRM-HR,SWATH等相关技术，参与发表相关论文30余篇。
李溱
博士，副教授。中国农业大学生物学院，植物生理学与生物化学国家重点实验室，中国农业大学“985”功能基因组中心生物质谱实验室。李博士1999年毕业于北京师范大学，获得理学学士学位，2007年毕业于美国德克萨斯州Texas A&M大学，获得博士学位。2008年-2009年在University of Illinois at Urbana-Champaign从事博士后研究，2011年至今，就职于中国农业大学生物学院，负责生物质谱实验室日常运行，对外提供蛋白质组学和代谢组学技术服务，开展基于高分辨质谱技术的植物代谢组学和蛋白质组学研究工作。
廖日晶
博士，副研究员。2006.9-2011.7于中科院上海有机化学研究所硕博连读，研究方向为天然产物抗生素的生物合成机制，2011.8-2015.5于诺华（中国）生物医学研究所从事博士后研究，研究方向为运用生物质谱技术开发组蛋白后修饰的新型分析方法学。2015年6月至今任中科院上海临床研究中心副研究员，从事生物质谱技术在基础以及临床科研方面的运用和开发新型分析方法学的研究。在攻读博士与博士后期间，以第一作者身份在美国化学会志（JACS IF: 13.0）、分析化学（Analytical Chemistry IF: 5.9）、化学和生物学（Chemistry & Biology IF: 6.6)等重要刊物上发表多篇论文。
沈诚频
博士，2005年毕业于复旦大学化学系，获得理学学士学位；同年保送至复旦大学生物医学研究院攻读博士学位，师从复旦大学生物医学研究院常务副院长杨芃原教授，2011年获得理学博士学位，攻读博士学位期间，作为访问学者于2009年-2011年前往美国麻省理工大学生物工程系交流学习。主要开展的工作包括：人肝蛋白质组学，蛋白质组学信息学，糖蛋白质组学。于2011年作为应用科学家加盟康昱盛信息科技有限公司生物信息学部，并于2013年聘为公司高级应用科学家及生物信息学部主管，主要负责蛋白质组学及生物通路分析软件和方法的技术支持及方案咨询。
唐家澍
博士，2006年毕业于南京大学理科强化部，生物化学专业，获得学士学位。2013年毕业于中科院上海生化所，师从曾嵘研究员，主要从事蛋白质组学技术和应用研究。随后在中科院上海生科院系统生物学重点实验室进行了为期两年的博士后训练，主要从事系统生物学和基于分子生物学的功能研究。从2016年1月开始，在赛默飞世尔科技色谱质谱事业部担任应用工程师，主要擅长磷酸化蛋白质组学技术，定量蛋白质组学技术以及质谱数据的生物统计学和生物信息学分析。
吴泽明
赛默飞质谱代谢组学业务发展经理，2012年毕业于中科院大连化物所，同年加入Thermo,先后任Chemist、Application Scientist与北区技术负责人等职。近10年来一直从事和密切介入基于质谱技术的代谢组学、脂质组学相关研究，在PNAS、MOL BIOSYST等杂志发表论文多篇。现专注致力于质谱与各种分离技术在Metabolomics/Lipidomics及其在疾病、生物功能与食品组学等方向的应用方法开发、技术支持和科学项目合作。
张伟
博士，赛默飞转化医学业务发展经理，在Chem. Comm., Anal. Chem., J. Proteome Res., Proteomics, J.Proteomics等知名杂志上发表论文14篇，其中第一作者10篇。2012年毕业于复旦大学生物医学研究院，获博士学位；2012年加入赛默飞公司，从事生物质谱与蛋白质组学领域的研究、技术开发、市场开拓工作。
周岳
毕业于中国科学院生物物理研究所，致力于蛋白质组学，生物制药的应用开发，技术支持和科学研究工作。在生物质谱蛋白定性分析，翻译后修饰以及蛋白定量方面有丰富的经验，参与完成多篇高水平文章的质谱工作。在赛默飞世尔科技担任质谱应用工程师期间，优化了QE系列产品，fusion系列产品在蛋白质组学应用中的质谱参数，并在Orbitrap用户中进行推广。建立了基于QE,Fusion的DIA数据采集以及数据分析流程，实现了7500个蛋白的DIA定量分析。
3. 蛋白质组学数据搜库及FDR的控制
蛋白质组学中，各种软件对质谱得到的谱图进行搜库时通常是利用以下三种方法之一进行：
2.实验和计算得到的谱图的自相关性（最先应用于SEQUEST）；
3.计算观测到的理论碎片质量和实际碎片质量之间匹配上的数目来自于偶然的概率（Mascot中率先使用）。
针对Andromeda肽段搜索引擎做些介绍：
嵌入到MaxQuant中Andromeda肽段搜索引擎就是基于二项式分布概率对肽段-谱图进行打分的，同时利用该得分进行后续的分析，如：对肽段进行排序、确定肽段修饰的可能性；standalone Andromeda可以处理少量的谱图，每张谱图经处理后都可以得到对应的有得分的肽段列表和蛋白列表，没有严格的FDR的控制。
Andromeda的优势展现在：1.确定同一肽段的多种修饰；2.解析混合谱图。
结合Proteome Discoverer 2.2中应用的算法，对一些细节进行解释。