Ⅰ 包涵体的实验方法
1、机械破碎
2、超声破碎
3、化学方法破碎 可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如有人在pH>9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。
变性剂的使用浓度和作用时间:一般在偏碱性性的环境中如pH8.0-9.0,尿素在碱性环境中不睁团稳定,一般不要超过pH1.0。有些蛋白只能用盐酸胍如IL-4。增溶时一般室温过夜,但盐酸胍在37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。 通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构,同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始,到2M左右时结束。对于盐酸胍而言,可以从4M开始,到1.5M 时复性过程已经结束。
复性中常采用
稀释复性:直接加入水或缓冲液,放置过夜,缺点是体积增加较大,变性剂稀释速度太快,不易控制。
透析复性:好处是不增加体积,通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度,有人称易形成沉淀,且不适合大规模操作,无法应用到生产规模。超滤复性:在悉凯橘生产中较多的使用,规模较大,易于对透析速度进行控制,缺点是不适合样品量较少的情况,且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。
柱上复性:是研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法,如华北制药的G-CSF复性据说是通过柱上复性进行的。常用于复性的层析方法有SEC、HIC等。 还原剂一般和变性剂的去除一起慢慢的氧化去除,使二硫键慢慢形成。但是由于二硫键的形成并不是蛋白质正确折叠所必须的,可以考虑在变性剂完全去除之后,在去除还原剂使已经按照正确的结构相互接近的巯基间形成正确的二硫键。
常用的氧化方法有:
空气氧化法:在碱性条件下通空气,或者加入二价铜离子,能够取得更好的效果,缺点是不易控制氧化还原电势。
氧化还原电对(redox):常采用GSSG/GSH,通过调整两者的比例来控制较精确的氧化还原电势,也可以在添加了还原剂如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG,如:5mMGSSG/2mM DTT=GSH/GSSG(1.33/1)。 1、共溶剂:如PEG6000-20000,据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团,此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会,也可能对复性效率的提高起作用。一般的使用浓度在0.1%左右,具体条件可根据实验条件确定。
2、二硫键异构酶(PDI)和脯氨酸异构酶(PPI):PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合,从而有利于恢复到正常的结构,此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的孙毕转变需要较高能量,常常是复性过程中的限速步骤,而PPI的作用是促进两种构象间的转变,从而促进复性的进行。
3、分子伴侣,即热休克蛋白(HSP),是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子,研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株,据说效果不错。不过在生产中还没有看到2和3的应用的例子。
4、0.4-0.6ML-Arg:成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中,可以抑制二聚体的形成。
5、甘油等:增加黏度,减少分子碰撞机会,一般使用浓度在%5-30%。
6、一定的盐浓度,可能是为了降低某些带电集团间的斥力,有利于蛋白质的折叠。
7、辅助因子:添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等很多时候对蛋白质正确的折叠是有利的。
8、色谱法:通过将目标蛋白结合到层析柱上,减少蛋白分子间的相互影响,该方法得到越来越多的应用,常用的色谱有SEC、HIC、IEC、IMAC等。
当然,虽然有很多所谓的理性的复性方案设计,复性工作更多的是一个经验的过程,没有一种通用的方法可以套用。 根据具体的蛋白性质和需要,可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。
1、凝胶电泳:一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质,或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。
2、光谱学方法:可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱(CD)等,利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测,但一般只用于复性研究中的过程检测。
3、色谱方法:如IEX、RP-HPLC、CE等,由于两种状态的蛋白色谱行为不同。
4、生物学活性及比活测定:一般用细胞方法或生化方法进行测定,较好的反映了复性蛋白的活性,值得注意的是,不同的测活方法测得的结果不同,而且常常不能完全反映体内活性。
5、黏度和浊度测定:复性后的蛋白溶解度增加,变性状态时由于疏水残基暴露,一般水溶性很差,大多形成可见的沉淀析出。
6、免疫学方法:如ELISA、WESTERN等,特别是对结构决定簇的抗体检验,比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。 1、MHCⅡ JBC 269(47):1994
增溶:16-40mg Protein,8MGdnHCl,16-32mM DTT,1mM EDTA,50mM Tris pH8.037度1hr.
复性:8-16fold dilution to1-5mg/ml Protein.
2、增溶:10mM DTT,0.1%SDS,25mM Tris,200mMGlucine pH8.5.
复性:10倍稀释到10mM DTT,2mMDodOMalt(dodecyl-beta-D-maltoside),150mMNaCl,10mMTris pH8.0.对起始缓冲液密闭透析16hr,开口透析8hr,对150mMNaCl,10mM Tris pH8.0透析48hr。
3、Bovine Prethrombin-2,JBC 270⑴:1990 四对二硫键。
增溶:7M GdnHCl,10mMTris pH8.0,1mM EDTA 4mg/ml.
复性:稀释到100mM Na2HPO4,2 mM EDTA,0.1% PEG,0-4M GdnHCl,0.1 mM GSSG,0.2 mM GSH,pH7.4,0.025 mg/ml Protein.RT 24hr.对4L 25mM sodiumphosphate,2mM EDTA,0.1%PEG,pH7.4 透析3次,温度4度。 一般说来,复性液的体积较大,为了减少处理体积,在进行柱纯化以前可以先进行硫酸铵沉淀,沉淀在低速离心收集后复溶的盐浓度较高,可以直接进行HIC纯化,目标峰经适当稀释后(cond<5mS/cm)进行IEX纯化,然后通过SEC脱盐,更换缓冲液,除菌过滤后,在质量合格的情况下便可以进入制剂阶段。
当然在复性浓度较高的情况下,也可以直接将复性液进行IEX纯化,优点是在纯化的同时进行体积的浓缩,为以后的精制创造条件。
从生产的角度看,由于每增加一步纯化工序便降低很多收率,所以可过两到三次柱纯化,工艺越简单越有利于收率的提高。当然这只是一个一般的原则,对于纯度要求较高的产品如重组人白蛋白,不得不进行多次纯化。 1. 真核细胞表达外源蛋白质的缺点
一些蛋白质需要翻译后的修饰,如糖基化,则必须选用真核细胞。但是无论是正在临床的还是市场上的蛋白质药物,主要的是以大肠杆菌作为宿主细胞。
1982年第一次选用大肠杆菌作为表达重组DNA的宿主细胞,表达的产物是人胰岛素。选择原核细胞作为表达载体,因为真核细胞表达外源蛋白质有其缺点:⑴真核细胞的天然蛋白质的表达和外源蛋白质的表达,表达量相当少,即使有的蛋白质表达量高时,容易出现蛋白质的无活性的现象,或者形成聚集体;而原核细胞表达的蛋白质量比真核细胞大很多;
⑵相对于大肠杆菌,人类对于真核细胞的基因的了解还是有限的,而对大肠杆菌的基因了解的相当透彻,并能进行熟练的基因重组等操作对大肠杆菌的基因进行改造;
⑶真核细胞生长到高密度需要更长的时间(7天左右),并且细胞的最终浓度低,所以需要较大的培养容器,而大肠杆菌可以在几个h以内达到108cells/mL;
⑷动物细胞生长的培养液的造价较高,并且大部分使用血清作为生长液的添加剂,从而提高了产品的造价并且不利于以后的纯化步骤;
⑸原核细胞的坚硬的细胞壁,可以使用简单的搅拌的方法完成传热、传质过程,而大部分的真核细胞需要温和的培养方法及复杂的操作以达到其对培养基的要求。
基于以上的原因,真核细胞尤其是哺乳动物细胞表达外源蛋白质大部分处在研究阶段,大部分重组蛋白质使用的表达载体是大肠杆菌细胞。大肠杆菌表达的外源蛋白质量相当大,有时达到细胞内蛋白质总量的5-20%,甚至达到50%以上。但是,大肠杆菌表达的蛋白质,当含量相当大时,有时由于原核细胞缺少分泌到胞外的机制或者折叠的机制,最后表达的蛋白质往往以无活性的包涵体的形式存在。
2. 包涵体表达蛋白质的优越性
为了研究基因的功能,可以把体内的基因转移到其他表达宿主中,研究基因表达性状以确定基因的功能。但是,外源基因的表达,特别是真核生物基因在大肠杆菌中的表达,由于宿主菌缺乏此种基因表达的调控机制,细胞内的化学环境与其天然环境差异,如氧化还原环境、胞内pH、自由水的浓度,以及外源基因的导入,使得表达目的蛋白质的细胞在非正常状态下生长,表达的蛋白质多数以无活性的包涵体的形式存在。
在下游生产过程中特别是在医药生产中,以包涵体形式表达的蛋白质具有一些优越性。
⑴ 异源表达的蛋白质很容易被宿主细胞内的蛋白质酶降解,如果重组蛋白质以包涵体形式表达,由于包埋了酶攻击的位点,可以最大限度地抵抗蛋白质酶的攻击;
⑵ 包涵体表达的蛋白质没有活性,细胞破碎和以后的纯化步骤不用考虑蛋白质的失活问题;
⑶ 包涵体形式表达的蛋白质与宿主细胞的其他蛋白质的分离比可溶蛋白质的分离方法简便,造价低,使用简单的离心或者过滤的手段就能使包涵体与宿主细胞的其他蛋白质成分进行有效的分离;
⑷ 有些表达的外源蛋白质对细胞有毒性或者致死,大量表达时会导致细胞的死亡,最终的细胞数量和产物相当低;而包涵体形式的蛋白质由于丧失了生物活性从而可以高效大量地表达;
⑸ 对于以包涵体形式表达的产物可以比较容易进行在线观测定性,含有包涵体蛋白质的细胞有较大的折射率,不必像可溶的蛋白质需要细胞破碎后使用酶学或者电泳学的方法进行鉴定。
包涵体的形成和蛋白质在等电点或者高盐情况下的沉淀是不同的。在沉淀过程中,分子是通过分子表面的相互作用而形成的分子的聚集,无论在聚集的沉淀状态还是在天然状态,没有明显的构象的变化。因此,当溶液中的pH重新改变,或者沉淀重新溶解的时候,蛋白质的结构和活性会重新获得。蛋白质的包涵体形式的聚集则不同于蛋白质的沉淀,把包涵体蛋白质直接溶解在天然的缓冲液中得不到天然的构象,无活性的聚集体与其天然活性形式之间没有自然的平衡转化的过程。包涵体的形成是由于范氏引力、疏水作用力和二硫键等作用力形成的,破坏这些作用力比较困难,溶解包涵体需要加入强的变性剂破坏多肽链之间的作用力,说明聚集体的多肽链之间的作用力远远大于普通的沉淀的分子间的作用力。当变性剂溶解的包涵体只是简单地通过稀释或者透析除去变性剂,而不是寻找合适的复性的条件的话,聚集体会重新形成,并且,不同于沉淀溶解的100%的活性的保留,包涵体的复性水平往往很低。所以,蛋白质沉淀是活性的天然蛋白质之间的作用力形成的,而包涵体的形成是在细胞内新合成的蛋白质肽链中间体而形成的,体外折叠时的聚集体是折叠过程中折叠中间体形成的。这些折叠的中间体并不一定是形成高级天然结构的中间体,从天然结构也不能推论出折叠中间体的构象。
Ⅱ DTT溶液怎么配 用于蛋白质凝胶电泳的上样buffer
1、1mol/lDDT溶液配制方法:用20ml
0.01mol/L乙酸薯嫌运钠溶液(pH5.2)溶解3.09g
DTT,过滤除菌后分数梁装成1ml小份贮存于-20℃。
注意者明:DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理。
2、SDS-样品缓冲液:SDS100mg,巯基乙醇0.1ml,甘油1ml,溴酚蓝2mg,加入0.2mol/lpH7.2磷酸盐缓冲液0.5ml溶解;
Ⅲ 固体试剂配制公式
以近似认为c(mol/L) =b(mol/kg) 计算
132种常用试剂配置方法,可谓是史上最全,可收藏,可复制,可索取。
话不多说,看目录,目录后面就是各种配方详情,可以按照编号进行查找。
如果需要更多详情,请联系客服索取。
常用缓冲液1、1M Tris-HCl;2、1.5 M Tris-HCl;3、10×TE Buffer;4、3 M 醋酸钠;5、PBS Buffer;6、10 M醋酸铵 7、Tris- HCl平衡苯酚 8、苯酚/氯仿/异戊醇9、10%(W/V)SDS 10、2N NaOH11、2.5 N HCl 12、5 M NaCl 13、20%(W/V)Glucose14、Solution I15、Solution II 16、Solution III17、0.5M EDTA 18、1 M DTT 19、10mM ATP
Ⅳ 含二硫键蛋白加多少DTT
含二硫键蛋白加1-2mMDTT。
DTT是一种硫醇码旁还原剂,当其浓度达到50mM时可促进大多数蛋白的半胱氨酸残基被还原。一般1-2mM起到保护蛋白-SH的作用,10mM以上就可以破坏已经形成的二硫键。
还原剂可以使蛋白质的二硫键打开,比如2-巯基乙醇(beta-ME)、二硫苏糖醇(DTT),二硫键是2个-SH基被氧化而形成的-S-S-形式的硫原子间的键。
功能
二硫键与蛋白质高级结构的生物活性有关,同时与蛋白质的复性也有关联。如核糖核酸酶A经巯基乙醇(还原剂)和尿素(蛋白质变性剂)处理后,发生变性作用,4对二硫键断裂,多肽链伸展开来,高级结构发生变化,失明模配去生物活性。
如果用透析法将大量还原剂和变性剂除去,在微量还原剂存在下,4对二硫键在原来的位置重新形成,伸展开的多肽肽链会自发折叠成天然构象,生激指物活性得到恢复。此试验也证明蛋白质高级结构的信息存在于一级结构中。
以上内容参考:网络-二硫键
Ⅳ 在SDS-PAGE中,用碘乙酰胺处理样品的大致步骤是什么,有什么特别注意的没有
样品首猜皮先穗凳差与粗敏10mM DTT 56度反应15min左右,加入IAM2.5%15min,之后95度煮沸上样可
Ⅵ dtt能再次把烷基化化的多肽蛋白还原吗
有还原烷基化蛋白质消化操作流程
1. 将所选择的胶点用1.5mm切胶笔切下,置于eppendorf (EP) 管或96孔PCR板
中,并记录点号及相应的位置;
2. 加50μL DD.H2O 洗两次,10min/次;
3. 加50 mM NH4HCO3/乙腈=1:1溶液50μL,超声脱色5min或37℃脱色20min,
吸干;
4. 重复步骤3,直至蓝色褪去;
5. 加乙腈50μL脱水至胶粒完全变白,真空抽干5min;
6. 加10 mM 二硫苏糖醇DTT(10μL 1M DTT,990μL 25mM NH4HCO3配制) 20
μL,56℃水浴1hr;(1.54mg/ml)
7. 冷却到室温后,吸干,快速加55 mM 碘代乙酰胺IAM (55μL 1M IAM,945
μL 25mM NH4HCO3配制)20μL,置于暗室45min; (10.2mg/ml)
8. 依次用25 mM NH4HCO3、50%乙腈溶液和乙腈洗,乙腈脱水到胶粒完全变白为
止,真空抽干5min;
9. 将0.1μg/μL的trypsin酶储液以25 mM NH4HCO3稀释10倍,每EP管加2μL,
稍微离心一下,让酶液充分与胶粒接触,4℃或冰上放置30min,待溶液被胶块完全吸收,加25mM NH4HCO3 10-15μL置37℃,消化过夜;
10. 加入2%TFA(三氟乙酸)终止反应,使TFA终浓度为0.1%,振荡混匀,离心。
说明:
1.每加一次溶液都要漩涡振荡,胶粒要完全浸没在溶液中,进行下一步操作前要把溶液吸走。
2.如果胶粒超过1.5mm3,把胶粒分成约为1.5mm3大小再进行脱色,使用的各种溶液樱枝的量也相应增加。
3.实验过程中一定要注意使用的溶液和器具的洁净,防止角蛋白污染,并戴口罩和帽子。
4.银染蛋白质点胶内消化不要脱色,步骤3、4省略, 如果需要脱色,使用100mM Na2S2O3与30mM K3Fe(CN)6 1:1混合溶液拿毕,脱色后用水洗到胶颜色透明为止。
需要准备的试剂:
乙腈,碳酸氢铵,DTT,IAM,trypsin,TFA,水
Digest SOP
双向电泳考脊敏敏染点无还原烷基化胶内消化操作流程
1.将所选择的胶点用1.5mm切胶笔切下,置于eppendorf (EP) 管或96孔PCR板
中, 并记录点号及相应的位置;
2.加30μL DD.H2O 洗两次,10min/次;
3. 加50 mM NH4HCO3/乙腈=1:1溶液30μL,超声脱色5min或37℃脱色20min,吸干;
4.重复步骤3,直至蓝色褪去;
5.加乙腈30μL脱水至胶粒完全变白,真空抽干5min;
6.将0.1μg/μL的酶储液以25 mM NH4HCO3稀释10倍,每EP管加2μL,稍微离心一下,让酶液充分与胶粒接触,4℃或冰上放置30min,待溶液被胶块完全吸收,加25mM NH4HCO3 10-15μL置37℃,消化过夜;
7.加入2%TFA终止反应,使TFA终浓度为0.1%,振荡混匀,离心。
说明:
1. 每加一次溶液都要漩涡振荡,胶粒要完全浸没在溶液中,进行下一步操作前要把溶液吸走。
2.如果胶粒超过1.5mm3,把胶粒分成约为1.5mm3大小再进行脱色,使用的各种溶液的量也相应增加。
3.实验过程中一定要注意使用的溶液和器具的洁净,防止角蛋白污染,并带口罩和帽子。
Digest SOP
全蛋白溶液消化操作规程
一、 试剂:
1.变性缓冲液:6M Guanidine-HCl,50mM Tris-HCl,(pH8.0)或6-8M 尿素,50mM
Tris-HCl,(pH8.0)
2.1M DTT
3.1M IAM
4.50mM NH4HCO3(pH7.8)
5.Trypsin酶
二、 操作步骤:
1.将蛋白溶解于6M Guanidine-HCl或6-8M 尿素或0.1% SDS, 50mM
Tris-HCl,(pH8.0);
2.往溶液中加入1M DTT至终浓度2-5mM;
3.95℃加热15-20min或者60℃加热45-60min,冷却至室温;
4.加入1M IAM至终浓度10-25mM,室温暗处孵育45min;
5.加入50mM NH4HCO3(pH7.8)稀释Guanidine-HCl或尿素至终浓度不超过1M;
6.按Trypsin酶与底物蛋白的量之比在1:20-1:100之间,加入酶液,37℃孵
育8-12Hr;
7.再次加入同等剂量的Trypsin酶溶液,室温孵育24Hr;
8.加入2%的甲酸(FA)到终浓度0.1%终止反应;
9.浓缩样品到合适的体积。
注意事项:
1.样品中避免存在以下常见的胰蛋白酶抑制剂
Antipain (50µg/ml), antithrombin (1unit/ml), APMSF (0.01–0.04mg/ml), aprotinin
(0.06–2µg/ml), leupeptin (0.5µg/ml), PMSF (17–170µg/ml), TLCK (37–50µg/ml),
trypsin inhibitors (10–100µg/ml).
Digest SOP
SDS-PAGE蛋白质条带消化操作流程
1. 将所选择的胶条用手术刀片切下,置于eppendorf (EP) 管中,并记录条带号及相
应的位置;
2. 把条带切成2mm3大小;
3. 加200μL DD.H2O 洗两次,10min/次;
4. 加50 mM NH4HCO3/乙腈=1:1溶液200μL,超声脱色5min或37℃脱色20min,
吸干;
5. 重复步骤4,直至蓝色褪去;
6. 加乙腈200μL脱水至胶粒完全变白,真空抽干5min;
7. 加10 mM DTT(10μL 1M DTT,990μL 25mM NH4HCO3配制) 50μL,56℃
水浴1hr; (10mM DTT 1.54mg/ml)
8. 冷却到室温后,吸干,快速加55 mM IAM (55μL 1M IAM,945μL 25mM
NH4HCO3配制)50μL,置于暗室45min; (55mM IAM 10.2mg/ml)
9. 依次用25 mM NH4HCO3、50%乙腈溶液和乙腈洗,乙腈脱水到胶粒完全变白为
止,真空抽干5min;
10. 将0.1μg/μL的酶储液以25 mM NH4HCO3稀释10倍,每EP管加40μL,稍微
离心一下,让酶液充分与胶粒接触,4℃或冰上放置30min,待溶液被胶块完全吸收,吸走多余的酶液,加25mM NH4HCO3 30-45μL置37℃,消化过夜;
11. 加入2%甲酸FA终止反应,使FA终浓度为0.1%,振荡混匀,离心;
12. 取出溶液转到新的EP管,加50ul 60%ACN含0.1%FA的溶液超声20min萃取,
合并溶液;
13. 溶液真空干燥;
14. 加入0.1%FA的水溶液20ul溶解多肽。
说明:
1.每加一次溶液都要漩涡振荡,胶块要完全浸没在溶液中,进行下一步操作前要把溶液吸走。
2.实验过程中一定要注意使用的溶液和器具的洁净,防止角蛋白污染,并带口罩和帽子。
3. 酶液不要反复冻融。
4. 银染不用脱色,可以减少第4,第5步,如果想要脱色,可以用30mM K3Fe(CN)6与100mM的溶液1:1混合,银颜色褪去后,用25mM NH4HCO3溶液洗到胶颜色透明,
接着第6步。
5. 如果用MALDI检测,第14步加入0.1%TFA的水溶液5-10ul溶解多肽。
Ⅶ 1M的DTT怎么配
在二硫苏糖醇5g的原装瓶中加32.4ml水,分成小份贮存于-20℃。
或转移100mg的二硫苏糖醇至微量离心管,加0.65ml的水配制成1mol/L二硫苏糖醇溶液。