A. 按照国标GB21311-2007做硝基呋喃代谢物检测，在摸质谱条件MRM的时候怎么检测不到目标离子对啊
能否提问的更详细些？
四个离子对是指硝基呋喃的代谢物AOZ，AMOZ，SEM，AHD5么？
怎么不对？是找不到离子对做SRM，还是质量数不对上？
可能有几个原因，比如Q1Q3的分辨率设置，也有可能液相分离不好，也有可能内标没做好。。。
雾水中
B. 硝基呋喃类代谢物标准物质浓度
浓度是0.04/M mol•L，呋喃西林的代谢物 氨基脲(SEM)是硝基呋喃类(Nitrofurans,本文中简式NFs)药物中呋喃西林的代谢物。
C. 半挥发性有机化合物 (semivolatile organic compounds)的测定
半挥发性有机化合物系指可在有机溶剂中分配，同时可进行气相色谱分析的一大类化合物。按照萃取条件的不同还可将这一大类有机物区分为碱-中性可萃取有机物和酸性可萃取有机物，包括有机氯农药、多氯联苯、有机磷农药、多环芳烃类、氯苯类、硝基苯类、硝基甲苯类、邻苯二甲酸酯类、亚硝基胺类、苯胺类和氯代苯胺类、卤代烃类、卤代醚类、联苯胺类、氯代联苯胺类、呋喃类、苯酚类、氯代酚类和硝基酚类等。在工农业生产发展的同时，这类有机污染物在环境样品中广泛存在。
气相色谱-质谱法 (GC-MS)
方法提要
分别在碱性和酸性条件下，以二氯甲烷萃取水和废水中的半挥发性有机化合物，被浓缩后的有机溶液可直接进行 GC-MS 分析，或者经过进一步净化，再以 GC-MS 检测。
方法的检出限见表82.20 (随仪器和操作条件而变) ，适用于饮用水、地表水、地下水、海水和工业废水等的监测。
表82.20 碱-中性、酸性可萃取有机物
续表
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仪器和装置
气相色谱-质谱仪，EI 源，带分流 (不分流) 进样口。
自动进样器，样品瓶 1.5mL。
旋转蒸发器或 KD 浓缩器。
10μL 微量注射器。
2L 分液漏斗。
300mL 具塞三角烧瓶。
300mL 具塞茄型烧瓶 (旋转蒸发器用) 。
试剂
净化水 用正己烷洗涤过的蒸馏水或纯净水。
氯化钠 优级纯，在 350℃下加热 6h，除去表面吸附的有机化合物，冷却后保存于干净的试剂瓶中。
无水硫酸钠 优级纯，在 400℃下加热 6h，除去表面吸附的有机化合物，冷却后保存于干净的试剂瓶中。
氢氧化钠 优级纯，配置成 10mol/L 水溶液。
二氯甲烷 残留农药分析纯。
正己烷 残留农药分析纯。
丙酮 残留农药分析纯。
硫酸 优级纯。
标准储备溶液 (浓度为 1000mg/L) 准确称取 0.0100g 的标准纯品 (纯度在 96% 以上) ，溶解在丙酮或者其他合适的有机溶剂中，之后定容至 10mL 容量瓶中 (或者购置商品标准储备溶液) 。将标准储备溶液转移至带聚四氟乙烯密封垫的螺旋盖样品瓶中，在- 10℃ 以下的温度下避光保存。
内标和替代物溶液 (1000μg/mL) 推荐的内标和回收率指标物 (表82.21) ，称取化合物 0.0100g，溶于少量二硫化碳中，转移至 10mL 容量瓶中并用丙酮稀释至刻度，最终溶液中的二硫化碳体积浓度约为 20%。除苝-d12外，大多数化合物可溶解于少量的甲醇、丙酮或甲苯中。-10℃ 以下避光保存。使用时将该溶液用丙酮稀释至 100μg/mL，每1000mL 水样中加入 1mL 此溶液，样品中每种替代物的浓度为 100μg / L。
GC-MS 校准溶液为 50μg / mL 十氟三苯基膦 (DFTPP) 的二氯甲烷溶液。
表82.21 推荐的内标和替代物
样品采集与保存
样品必须采集在玻璃瓶中。自采样后到萃取时，所有样品必须在 4℃冷藏，水样充满样品瓶。如果有余氯存在，每 1000mL 样品中需要加入 80mg 硫代硫酸钠。所有样品必须在7d内完成萃取，萃取液在40d内完成分析。
分析步骤
1)萃取。将1L水样加入到2L分液漏斗中，加入1.00mL替代物标准溶液，混合均匀。用广泛pH试纸检查试样pH值，加入氢氧化钠溶液调节pH值大于11，样品瓶中加入60mL二氯甲烷，振摇30s冲洗瓶壁，之后转移至分液漏斗中。振动分液漏斗5min并周期性放气释放压力，静置10min，使有机相分层。如果乳化现象严重，需要采用机械手段完成两相分离，包括搅动、离心、用玻璃棉过滤等方法破乳(也可采用冷冻的方法破乳)。将二氯甲烷相收集在300mL三角烧瓶中，水相中再加入60mL二氯甲烷，重复上述液液萃取过程，将二氯甲烷相合并到300mL三角烧瓶中。以同样的方法重复第三次萃取，将合并的萃取物标明为碱-中性组分。用(1+1)H2SO4将水相pH值调至小于2，分别用60mL二氯甲烷萃取酸化的水相三次，合并二氯甲烷相，萃取物标明为酸性组分。
全部二氯甲烷相中加入少量无水硫酸钠，放置25min干燥，将二氯甲烷过滤至300mL茄形瓶中，用旋转蒸发器浓缩至2mL(也可用K-D浓缩器完成浓缩过程)，转移至10mL试管中，用N2吹脱至约1mL或更少，分析前加入适当的内标溶液，使其最终浓度为1μg/mL，用二氯甲烷定容至1mL，进行GC-MS分析。
在实际样品分析过程中，根据测定目标物不同，有时需要对上述萃取溶液进行净化处理(如表82.22所示)之后，再进行GC-MS分析。
表82.22 目标分析物及净化方法
2)标准曲线。用标准储备液配制至少5个不同浓度的校准曲线用标准溶液，每一浓度的标准溶液中加入已知量的一种或多种内标，其中有一个标准溶液浓度接近但高于方法检出限(MDL)，其余浓度应当对应实际样品中目标物的浓度。
3)GC-MS分析条件。色谱柱:DB-5或同等石英毛细管色谱柱，柱长30m，内径0.25mm或0.32mm，液膜厚度1μm。色谱分离条件:柱温40℃(4min)→10℃/min→270℃，保持直至苯并［ghi］苝流出。
载气(氦气)流速为30cm/s，无分流进样，进样时间2min，进样量1～2μL。
定性分析为全扫描方式，质量范围为35～500u，扫描时间1s/次。
定量分析为选择离子检测(SIM)，各化合物选择离子质量数(包括定量离子和参考离子)如表82.20所示，内标和回收率指示物的选择离子质量数如表82.21所示。
4)GC-MS系统性能测试。每天分析运行开始时，都必须以DFTPP检查GC-MS系统是否达到性能指标要求。性能测试要求仪器参数为:电子能量70eV，质量范围35～450u，扫描时间为每个峰至少有5次扫描，但每次扫描不超过1s。得到背景校正的DFTPP质谱后，确认所有关键质量数是否都达到表82.23的要求。
表82.23 DFTPP关键离子和离子丰度指标
定性及定量分析
1) 定性分析。本方法中测定的各化合物的定性鉴定是根据保留时间和扣除背景后的样品质谱图与参考质谱图中的特征离子比较完成的。参考质谱图中的特征离子被定义为最大相对强度的三个离子，或者任何相对强度超过 30%的离子。
2) 定量方法。定量方法为内标法，标准曲线为至少 5 点校正，内标浓度为 1μg / mL。在 SIM 检测方式下，以标准系列中各目标化合物峰面积与内标峰面积的比对目标化合物的浓度作图，得到该目标化合物的定量校准曲线。校准曲线的线性回归系数至少为0.9990。样品溶液在与标准溶液相同的分析条件下测定，根据样品溶液中目标物与内标物的峰面积比，由定量校准曲线得到该化合物的浓度。水样中该化合物的浓度计算如下:
岩石矿物分析第四分册资源与环境调查分析技术
方法性能指标
将标准样品加入到 1L 纯水中，使得每种目标物的浓度为 100μg/L，与试样分析步骤相同，在试样预处理之后进行 GC-MS 测定。计算 4 次结果的平均回收 (单位为 μg/L)和回收结果的标准偏差 (s，单位为 μg/L) ，表82.24 为方法的精密度和准确度，可作为实验室质量控制的指标，用来判断实际样品分析的可靠性。
表82.24 方法的精密度和准确度
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注: D 为检测出，检测结果 >0。
D. 硝基呋喃的检测
硝基呋喃类原型药在生物体内代谢迅速，无法检测。但其代谢产物因和蛋白质结合而保证长时间稳定存在。所以一般以硝基呋喃类药物代谢物为目标分析物的检测，来达到检测硝基呋喃类药物残留量的目的。 在检测前一般需要对样品进行处理，一般分为洗涤、水解和衍生化及净化等处理步骤，下面以国家标准检测方法（GB/T20752-2006）和行业标准方法（SN/T 1627-2005）为例介绍一下检测前处理的一般步骤。
洗涤
GB/T20752-2006：2g均质好的样品，15ml的甲醇-水（2+1），混匀1min，4000rmp离心，弃掉上清液。
SN/T 1627-2005：1g组织，不用洗涤。
水解和衍生化
GB/T20752-2006：加入20ml 0.2M盐酸，加入0.3ml的衍生化试剂（75mg 2-硝基苯甲醛溶于10ml二甲基亚砜，0.05M），37℃避光振荡16h。
SN/T 1627-2005：加入30ml 0.125M盐酸，加入1ml的衍生化试剂（100mg 2-硝基苯甲醛溶于12.5ml二甲基亚砜），37℃避光振荡16h。
净化
GB/T20752-2006：加入5ml 0.1M的磷酸氢二钾，并用1M氢氧化钠调pH到7.4，离心上清液过HLB柱，5ml乙酸乙酯洗脱，40 ℃ 吹干，定容到1ml（10ml乙腈+0.3ml，用水定容到100ml）
SN/T 1627-2005：加入4ml 1M的氢氧化钠，并用1M盐酸和0.1M氢氧化钠调pH到7-7.5，3000rmp离心10min，上清液倒入250ml的分液漏斗中，残渣用5ml水洗， 3000rmp离心10min，上清液也倒入250ml的分液漏斗中，加乙酸乙酯40ml，振摇1ml，静置3min，重复提取1次，合并乙酸乙酯，通过装无水硫酸钠的漏斗过滤至鸡心瓶中，50 ℃ 旋蒸至3-5ml，再转移到试管中， 50 ℃ 吹干，定容至1ml（0.1%乙酸：乙腈：甲醇 3：3：2）。 经过对样品检测前的处理后，就可以对样品中的硝基呋喃类药物代谢物残留量进行检测，有关猪肉、禽肉、水产品中硝基呋喃类药物代谢残留量测定的方法，国家有相应的检测标准，也有相关的行业标准，另外文献报道也有一些检测方法。国家和行业标准检测方法基本是液相色谱法或液相色谱-串联质谱法，区别在于提取溶液和净化方法上有差异，以及外标法或内标法定量的不同，检出限大多为0.5ug/kg。文献报道有固相萃取液相色谱-质谱法和液相色谱-串联质谱组合法，其中前者与国家、行业标准检测方法的检出限相同，后者检出限能达到0.03 ug/kg。
已公开的各类硝基呋喃类药物代谢物质残留的检测方法 编号 方法名称 方法简单介绍 1 猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法 样品中残留的硝基呋喃类代谢物在酸性条件下用2-硝基苯甲醛衍生化，正己烷脱脂，用HLB柱净化，点喷雾离子化，液相色谱-串联质谱检测，外标法或同位素内标法定量 2 动物源食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法
高效液相色谱/串联质谱法 样品中残留的硝基呋喃类代谢物在酸性条件下用2-硝基苯甲醛衍生化，乙酸乙酯提取，正己烷脱脂净化，点喷雾离子化，液相色谱-串联质谱检测，同位素内标法定量。 3 动物源食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量的测定
高效液相色谱-串联质谱法 样品依次用甲醇、乙醇、乙醚洗涤，在酸性条件下用2-硝基苯甲醛衍生化，乙酸乙酯提取，电喷雾离子化，液相色谱-串联质谱检测，同位素内标法定量。 4 进出口动物源食品中硝基呋喃类代谢物残留量测定方法
高效液相色谱串联质谱法 样品中残留的硝基呋喃类代谢物在酸性条件下用2-硝基苯甲醛衍生化，乙酸乙酯提取，氯化钠溶液反萃取净化，电喷雾离子化，液相色谱-串联质谱检测，同位素内标法定量。 5 水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定
液相色谱-串联质谱法 样品中残留的的硝基呋喃类代谢物在酸性条件下用2-硝基苯甲醛衍生化，乙酸乙酯提取，电喷雾离子化，液相色谱-串联质谱检测，同位素内标法定量。 6 水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定
高效液相色谱法 样品中残留的硝基呋喃类代谢物用三氯乙酸-甲醇溶液提取，经邻氯苯甲醛衍生化，乙酸乙酯提取，固相萃取柱净化，电喷雾离子化，液相色谱-串联质谱检测，外标法定量。 7 固相萃取高效液相色谱-质谱法测定动物组织中硝基呋喃代谢产物 样品中残留的硝基呋喃类代谢物在酸性条件下用2-硝基苯甲醛或2-氯苯甲醛衍生化，固相萃取柱净化，电喷雾离子化，液相色谱-质谱检测，同位素内标法定量。 8 液相色谱/串联质谱线性组合法测定动物组织中硝基呋喃类代谢产物 样品中残留的硝基呋喃类代谢物在酸性条件下用2-硝基苯甲醛衍生化，乙酸乙酯提取，氯化钠溶液洗涤，自制净化试剂净化，电喷雾离子化，液相色谱-串联质谱检测，同位素内标法定量。 除表格中介绍的检测方法用于猪肉、禽肉、动物性水产品中外，高效液相色谱或高效液相色谱-串联质谱法还可以用于测定奶粉 、蜂王浆 、饲料 中硝基呋喃类药物的含量。
E. 阿司匹林的含量测定
阿司匹林含量测定综述 08药学1班：冉贤飞
阿司匹林片为常用的解热、镇痛药，收载于(中国药典2000年版)二部。原含量测定方法为酸、碱中和滴定法。目前市场上流通的解热、镇痛药物中，含阿司匹林或以阿司匹林为主药的较多。除了中国药典的原含量测定方法以外，针对各个剂型有多种含量测定的方法。如采用高效液相法测定其含量，可消除其他含有酸、碱的物质对其测定的干扰，可更有效的控制制剂的质量。方法操作简便，专一性强，结果准确。也有用数学模型进行计算的如近红外漫反射技术，其原理是根据标样集中样品的近红外光谱运用化学计量学方法建立光谱特征值(如吸光度)与待测成分之间的数学关系(简称数学模型)
1．阿司匹林及阿司匹林制剂的含量测定
阿司匹林及阿司匹林制剂的含量测定有多种方法，其中包括药典所载的酸、碱中和滴定法
及紫外分光光度法，高效液相法等。
1．1阿司匹林酸碱滴定法：
直接滴定：方法：取本品0。4g，精密称定，加中性乙醇20ml，溶解，加酚酞指示液3d，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/l）滴定。每1ml滴定液相当于18。02mg 的C9H8O4
水解后剩余滴定：方法：取本品1.5g，精密称定加氢氧化钠滴定液（0.5mol/l）50.0ml，混合，缓缓煮沸10min，放冷，加酚酞指示液，用硫酸滴定液（0.25mol/l）滴定剩余的氢氧化钠。
两步滴定法：取本品10片，精密称定，研细，精密称取片粉适量（约相当于阿司匹林），加中性乙醇20ml,振摇使阿司匹林溶解，加酚酞指示液3d，滴加氢氧化钠滴定液（0.1mol/l）至溶液显粉红色。加定量过量的氢氧化钠滴定液（0.1mol/l）40ml，置水浴上加热15min并时时振摇，迅速放冷至室温，用硫酸滴定液（0.05mol/l）滴定剩余的碱。根据消耗的滴定液体积及滴定度计算含量
1．2阿司匹林制剂的电极法测定
仪器与试剂：电极电位和溶液酸度测试均使用pHs—loC型数字式酸度离子计；参比电极为232型饱和甘汞电极；试剂均为分析纯，实验用水为去离子水经高锰酸钾处理后蒸馏而得。
电极制备：将载体物质三苄基锡辛酸酯20mgl聚氯乙烯（PVC）0．33g和增塑剂邻硝基苯基辛醚o．65g溶解于四氢呋喃（THF）3g中，搅拌澄清后将其倾倒于40 mm×40 mm的水平玻璃板上。待THF挥发完后(约需l 2h)即得到具有弹性的PVC膜。用打孔器切下直径10 mm的圆片并用含5％PVC的THF溶液粘于PVC电极杆端,放置数小时,晾干后电极杆内充以0.1mol／L的水杨酸钠溶液作为内参比溶液并以Ag／AgCl丝作为内参比电极导出至离子计。电极使用前需于0.01mol／l水杨酸钠溶液中浸泡2h进行活化处理。电极及备用膜长期不使用时可洗净后．置于氮气氛围下保存。在此条件保存，电极的各项性能指标至少可于5个月内维持稳定。
阿司匹林制剂的分析：待测样品的处理： 阿司匹林易水解得到水杨酸根离子，且反应定量。因此，通过对水杨酸根离子的测定即可得出样品中的阿司匹林含量。阿司匹林片(A)和复方阿司匹林片（B）均处理如下：将适量药品(10片)研制成粉状，精密称取1—1．5g．在0.5mol／L NaOH溶液25m1中加热回流1h后过滤，定容至250 ml。吸取lOm1滤液，用稀硫酸调至pH 5．5，再用PH 5．5的磷酸盐缓冲液定容至100 mI作为待澜液。使用所配电极通过标准溶液法和样品加入法．分别测定药品A和B经前述处理后所得试样中的水杨酸根离子浓度，通过换算得出药剂中阿司匹林的含量
1．3 HPLC法测定阿司匹林片的含量
仪器与试药 仪器：高效液相色谱仪；CLASS—LC工作站。色谱柱：ODS C18色谱柱(150mm x 4．6mm，填料：Kromasil，粒度：5um)。 试药 阿司匹林对照品，甲醇(色谱纯试剂)，冰醋酸、盐酸(分析纯试剂)。
取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于阿司匹林10mg)，置100m1量瓶中，加0．1mol/l盐酸溶液适量，超声使阿司匹林溶解，放冷至室温，加0．1mol/l盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5m1，置25m1量瓶中，加0．1mol/l盐酸溶液稀释至刻度，格匀，取20ul注入液相色谱仪，记录色谱图。另取阿司匹林对照品适量，加0．1mol/l盐酸溶液溶解并稀释制成每l m1中约含阿司匹林20ul的溶液，取20ul同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。
1．4动力学光度法测定痕量乙酰水杨酸
原理：碘对Ce4+和As的氧化还原反应有明显的催化作用，乙酰水杨酸和碘容易发生取代反应，使碘的浓度降低，导致碘的催化作用减弱，由此建立动力学光度法测定痕量乙配水杨酸的新方法。
仪器和试剂：721型分光光度计；PHS—3C酸度计；超级恒温水浴。0．01mol/lCe(SO4)2 0．013mol/L AS2O3，5mol/l H2S04 , 5mg/l KI用时稀释至0．25mg/l ;150mg/l乙酰水杨酸标准溶液用时稀释至所需浓度；5％醋酸马钱子碱；实验用水为二次蒸馏水。
实验方法:于一系列25m1比色管中准确加入0．25mg/lKI溶液1．0m1，5mol/l H2S04溶液1．25m1，0．013mol/L AS2O3溶液1.0ml，乙酸水杨酸标准溶液(或样品溶液)，加蒸馏水至25m1刻度线。摇匀并放人35土0．1度的水浴中，恒温后加入0.01mol/l Ce〔S04)2 1.0ml，立即摇匀，迅速放回水浴中。反应10min后，加入0.5mol/l,0.5％的醋酸马钱子碱终止反应并与Ce4+—显色，置于沸水浴中煮沸3min，取出冷却至室温。用1cm比色皿，在波长520nm处，以蒸馏水为参比，测定吸光度A。
2．以阿司匹林为主药的含量测定
虽然其成分组成有差异，但大多仍是根据阿司匹林的化学或色谱性质加以分离并测定其含量。
2．1反相高效法相色谱法测定阿司匹林可待因片中阿司匹林含量
仪器和试剂：Hp-1050液相色谱仪及UV检测器，HP3396积分仪。磷酸可待因对照品、阿司匹林对照品 。甲醇、醋酸钠、冰醋酸均为分析纯试剂，阿司匹林磷酸可待因复方制剂(试制品)。
液相色谱条件：色谱柱ODS C18(10mm，300mm×4mm) 流动相：甲醇—0．03mol/L—l醋酸钠(冰醋酸调pH＝3．5)(1：2．5)；检测波长：280nm；流速：1ml/min.
测定方法
混合对照品溶液配制 准确称取在105℃干燥至恒重的磷酸可待因对照品适量。用水溶解，配制成浓度为0.8mol/l的溶液。准确称取阿司匹林对照品约40ml置10mL容量瓶中。加入甲醇2—3mL，溶解，精密加入上述磷酸可待因溶液1.0mL，用水定容至刻度，摇匀即得。
供试品溶液配制 精确称取样品细粉适量(约相当磷酸可待因8mg阿司匹林400mg)置100mL容量瓶中，加入25％甲醇溶液50mL，超声溶解5min。用25％甲醇溶液稀释至刻度，格匀。经0.45um微孔滤膜滤过，取续滤液为供试品溶液.
测定 精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各10uL，分别注入液相色谱仪中。记录峰面积。根据混合对照品溶液中磷酸可待因和阿司匹林的峰面积，计算出供试品溶液中二者的含量.
2．2小儿退热灵片紫外折合光谱测定
原理：摺曲线分析法是一种数学变换方法(它的数学属性是一种新的复合导数变换)。它根据谐波分析原理，将光谱吸收曲线看作是多个数学分量加权而成。由于它提供的信息量大，可以显示吸收曲线的细微差异，以减少相似组分的数学相关性，所以在物质定性和混合物定量方面具有明显的优点。
仪器与试药：UV／VIS W型裙合光谱仪及裙合光谱软件；阿司匹林(1)对照品(含量99．89％)、苯巴比妥(2)对照品(含量99．92％)和辅料(佳木斯化学制药厂)；小儿退热灵片
方法与结果：对照品溶液的配制：分别精密称取1、2对照品适量，用0．1mol／LNaOH溶液(溶剂)溶解稀释制成1mg／m1的储备液。再用溶剂稀释制成适当浓度的溶液(约120ug／m1，22．0ug／m1，使1和2的吸收度在0.2—0．8)，备用。模拟样品的配制 按原黑龙江地方标准药品处方比例称取1、2与适量的辅料混匀后，精密称取0．2g置小烧杯中，用溶剂溶解并定容至100m1，静置10min，再取5m1稀释至250m1。分别吸取16、17、18、19和20m1置各25m1量瓶中，用溶剂定容，得1浓度为20—25ug／m1、2浓度为2．0—2．5ug／m1的模拟样品溶液(使1和2的吸收度在0．2—1．2)，共5份。
样品测定：取本品12片，精密称定，研细，精密称取细粉适量(约相当于10．110g，20．011g)，用少量溶剂溶解后定容至50m1。按“2．3”项下方法选定的最佳折合区间(245—295nm)，经折合光谱自动采集该区间的光谱信息，以两组分定量分析系统软件进行裙合运算，并计算得含量
2．3近红外漫反射技术测定精氨酸阿司匹林的含量
原理：近红外定量分析需要一个待测成分已知的标准样品集(简称标样集)，根据标样集中样品的近红外光谱运用化学计量学方法建立光谱特征值(如吸光度)与待测成分之间的数学关系(简称数学模型)。当测定未知样品时，只需测定该样品的近红外光谱，然后用已建好的数学模型预测出待测成分的含量。与常规的光谱定量分析不同之处是，近红外光谱分析时所用样品可以不经预处理，通过求解光谱矩阵与待测成分的浓度矩阵来建立数学模型，进行定量。检测固体样品一般采用漫反射技术，对于液体样品的检测用透射方法。建立数学模型的方法主要有：多元线性回归、主成分法、偏最小二乘法等。贴算法相对而言是一种较新的多元数据处理技术，它与逐步回归、主成分回归的显着差异在于考虑全谱区各波长是光谱参数的同时，还兼顾了被分析样品内部各成分之间的关系，因此在NIR分析中得到广泛应用。
仪器：Bruker公司VECTOR22/N近红外光谱仪,带漫反射光纤探头波长区间4000-11000cm-1
样品: 精氨酸阿司匹林固体粉末含阿司匹林48．0％-53．0％, 蔗糖酯(片剂辅料，作为润滑剂)
实验方法：用1／1000扭力天平准确称取不同比例的精氨酸阿司匹林与蔗糖酯，共10份，分别混合均匀，用压片机压片，得到精氨酸阿司匹林含量不同的片剂(以此含量做为精氨酸阿司匹林片的理论含量一真值)，每种各100片。从每种100片中随机选取10片，用仪器的漫反射光纤探头压住药片，每片正反面各测1次，取平均光谱做为样品光谱。扫描区间为4000-11000cm-1，分辨率为8cm-1。用Bruker公司Bruker公司quant/2软件分析，光谱数据采用加性散射校正预处理，以消除药片表面不同引起的误差，即可得到测量值。
2．4阿司匹林精氨酸盐注射液含量测定
仪器与试药： 仪器 79—l电磁搅拌仪；紫外—可见分光光度计。精氨酸，阿司匹林，其余试剂均为分析纯。
标准曲线的绘制：精密称取阿司匹林结晶250．0 mg，悬浮于250mL蒸馏水中，在40一50度水浴中不断搅拌至溶解，冷却后移入500 ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀。精密吸取l，2，3，4，5mL分别置于50 mL量瓶中，加25mL蒸馏水，用o．1mol/LNaOH溶液调节pH至9一10，在沸水浴中加热5min，冷却后，用0.1mol/l盐酸溶液调节pH至3.0一4.0，加5滴硫酸铁铵指示液，再加蒸馏水至刻度，摇匀。在530 nm波长处测定吸收度A。线性回归得方程.
测定含量：精密称取阿司匹林精氨酸盐400．0 mg置l00mL量瓶中，加蒸馏水溶解，稀释至刻度，摇匀，过滤。取续滤液5mL，置50 mL量瓶中，在沸水浴中加热数分钟，冷却，加25mL蒸馏水，以下同标准曲线项下处理，在530 nm波长处测定吸收度A，计算阿司匹林精氨酸盐的含量。阿司匹林精氨酸盐的含量＝(测定值／称量值)×loo％，代入数据求得阿司匹林精氨酸盐的含量.
3．阿司匹林体内药物分析：
3．1反相高效波相色谱法测定阿司匹林血药浓度
1 仪器与试药：Waters2690高效液相色谱仪，配置有996二极管阵列检测器及Millennium数据处理系统；旋涡混合器(上海青浦沪西仪器厂)；TGL—16高速离心机(上海医用仪器厂)。 水杨酸、苯甲酸对照品(中国药品生物制品检定所)；磷酸为分析纯，乙睛为色谱纯；水为超纯水。
色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18柱(4．6mm×250mm，5um)，流动相为甲酵—乙睛—0．2％磷酸(18：32：50)，检测波长为237nm，流速为1.0ml／min。
溶液配制： 精密称取10．10mg水杨酸对照品，用甲酵溶解，并定容至10ml，得到1．010mg／L水杨酸的储备液，并用甲醇稀释成不同浓度的系列溶液。精密称取10．44mg苯甲酸，用甲酵溶解，并定容至10ml，得到1．044mg/l苯甲酸的储备液。取lml储备液，用甲醇稀释至loml，得到104．4ug／ml的内标工作液。
样品处理与测定：精密量取血清样品0．5nl，加入内标苯甲酸溶液(104．4ug／m1)50ul，乙睛2ml，旋涡振荡2min，15000r／min离心5min，取上清夜20ul，在上述色谱条件下进样，分别记录内标与样品的色谱图与峰面积。按外标法以峰面积计算，即得。
讨论
阿司匹林及其制剂有多种分析方法，但有其共同点。HPLC分析中，检测柱一般多采用C18柱，检测波长为280左右。滴定法都是根据药物中含游离羧酸的酸性进行滴定，或水解后用酸回滴。其他以数学模型等方法进行的测量，也都是基于阿司匹林的化学结构和性质。
参考文献：
刘 冬，阿司匹林制剂的电极法测定，中国医药工业杂志，1997，28（11）：512
王晓燕，高效液相色谱法测定复方阿司匹林片剂的含量，沈阳药科大学学报，2002，9（1）：31
杨 军，动力学光度法测定痕量乙酰水杨酸，新乡师范高等专科学校学报，2001，15（2）：77
南 楠，反相高效法相色谱法测定阿司匹林可待因片中磷酸可待因和阿司匹林的含量，药物分析杂志，1999，19（1）：7
侯 巍，小儿退热灵片中两组分的紫外裙合光谱测定，中国医药工业杂志，2004，35（3）：162 乔 梁，应用近红外漫反射技术测定精氨酸阿司匹林的含量，药物分析杂志，1998，18（5）：297
张晓云，阿司匹林精氨酸盐注射液的制备及其稳定性研究，西北药学杂志，2004，19（2）：71
张 丽，反相高效波相色谱法测定阿司匹林血药浓度，中国药房，2003，14（5）：289
F. 呋喃西林代谢物
呋喃西林（furacilin）是一种人工合成的广谱抗菌药，可以治疗畜牲疾病。近年来在畜牧、水产养殖中被广泛应用，但呋喃西林及其代谢物在动物源性食品中的残留可以通过食物链传递给人类，长期摄入会引起各种疾病，对人体有致癌、致畸胎等副作用。美国、澳大利亚、加拿大、日本、新加坡、欧盟等已明文规定禁止在食品工业中使用该类药物，并严格执行对水产中硝基呋喃的残留检测。日本肯定列表中已明文规定呋喃类药物在动物源性食品中不得检出。我国在2002年3月由农业部发布的《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》中将呋喃西林列为禁用药。
北京望尔科研人员通过不懈的努力，经过近长期的辛勤工作，终于攻克了技术上的重大难关，在世界上率先首家研制出呋喃西林代谢物ELISA快速检测试剂盒。该试剂盒采用酶联免疫技术分析方法研制，通过检测呋喃西林代谢物为主，以此间接测试呋喃西林。用HPLC和LC-MS-MS方法对比验证。测定结果表明ELISA检测试剂盒测定结果与HPLC或LC／MS测定结果相符合。且ELISA检测试剂盒具有灵敏度高、特异性强、定量判定准、样本前处理简单、检测速度快等优点，适合于一次性大批量样本快速筛选。可用于动物组织（肌肉、肝脏）、蜂蜜、肠衣、牛奶以及水产品等样品中呋喃西林代谢物残留的检测。
G. 从植物叶片中提取复合氨基酸
我也是从网上查到的你可以参考一下
1.3 方法�
1.3.1 供试样品的制备�
采取3个月生植株上的完整健全叶片，在80℃干燥箱中烘干，粉碎，准确称取0.5 g于10 mL安瓿瓶中，加入6 mol/L的HCl 7 mL，充入高纯N2，将安瓿瓶封口，置于105℃恒温干燥箱中消化过夜。冷却后过滤，滤液浓缩近干，加5 mL0.1 mol/L的HCl溶解，取1.5 ml至1.5 ml离心管中，10000转/min离心10 min，取上清液900 ul加入100ul 5nmol/ul内标物SAR，混匀后作为供试样品。�
1.3.2 标准溶液的制备�
5 nmol/L内标液制备：精密称取SAR 22.3 mg以0.1 mol/L HC1定容至50 mL。�
500 pmol/L内标液制备：精密吸取5 nmol/L内标液5 mL以0.1mol/L HC1定容至50 mL。�
900 pmol/L氨基酸混合标液制备：精密吸取900 ul 1000pmol/L氨基酸混合标液加入5 nmol/L内标液100 ul；�
225 pmol/L氨基酸混合标液制备：精密吸取900 ul 250pmol/L氨基酸混合标液加入5 nmol/L内标液100 ul；�
90 pmol/L氨基酸混合标液制备：精密吸取900 ul 100pmol/L氨基酸混合标液加入5 nmol/L内标液100 ul。�
1.3.3 色谱条件�
样品自动柱前衍生化程序：吸取硼酸缓冲液5 ul，再吸取OPA试剂1 ul，洗针1次，吸取样品1 ul，原位混合6次。吸取FMOC试剂1 ul，洗针1次，原位混合3次，进样。�
色谱柱：Hypersil AA-ODS C18 2．1×200 mm�
流动相A：醋酸钠1.36±0.025 g，加入纯水500 mL溶解，加EDTA溶液50 ul，再加三乙胺90 ul，用1％-2％ 醋酸调pH= 7.20±0.05，再加入四氢呋喃1.5 mL，混合均匀。�
流动相B：醋酸钠1.36±0.025 g，加入纯水100 mL溶解，用1％一2％ 醋酸调pH=7.20±0.05，将此溶液加至乙腈200 mL和甲醇200 mL的混合物中，并混合均匀。 �
柱温：40℃ 紫外检测波长：338 nm；�
梯度洗脱：流动相A：以0.45ml/min在0-17min由100%减至40%，17min-18min由40%减少至0；流动相B：以0.45ml/min在0-17min由0增至60%，17min-18min由60%增至100%，18.1min-23.9min流速由0.45ml/min-�0.80ml/min�，运行至24min结束。�
1.3.4 测定方法和数据处理�
分别精密量取对照品溶液和供试样品各1 ul，注入液相色谱仪，记录色谱图至脯氨酸峰出峰后即得。以3种浓度的标样制作校正表，按Agilent公司提供的氨基酸分析软件包进行数据处理。�
2 结果与分析�
2.1 紫苏属植物叶片中氨基酸组成及含量比较�
27份材料叶片中均测得17种氨基酸，其氨基酸种类较齐全。所测氨基酸中以甘氨酸平均含量最高，达6.68mg/g，其次是亮氨酸和谷氨酸，分别为4.77mg/g和4.59mg/g。与人体健康关系最为密切的赖氨酸平均含量有1.87mg/g。7种必需氨基酸总量平均为14.58mg/g，占氨基酸总量的比例为32.43%。�
氨基酸总量超过50 mg/g的材料共有6份（P06-11紫、P06-6、P06-7、P06-12紫、P06-15紫、P06-13），其中材料P06-7氨基酸总量最高，达57.65mg/g ，较总含量最低的材料P06-33多23.07 mg/g。17种氨基酸中有9种氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸）含量均以P06-7最高，而有6种氨基酸（丝氨酸、甘氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸）含量的最低值出现在P06-33中。必需氨基酸含量变化范围在11.10 -19.55 mg/g之间，仍以P06-7为最高。非必需氨基酸含量的变化趋势与氨基酸总量的变化趋势大致相同。�
�
各氨基酸在材料间的变异较大。变异系数最大的是脯氨酸，达59.19%，其次是组氨酸和赖氨酸，分别为29.91%和25.63%。异亮氨酸的变异系数最小，为11.34%，其它氨基酸的变异系数均在10%-20%之间。氨基酸总量、必需氨基酸和非必需氨基酸含量的变异系数在10%-15%之间。
H. 醋酸地塞米松的药理毒理
肾上腺皮质激素类药，其抗炎、抗过敏、抗休克作用比泼尼松更显着，而对水钠潴留和促进排钾作用很轻，对垂体-肾上腺抑制作用较强。
1、抗炎作用：本产品可减轻和防止组织对炎症的反应，从而减轻炎症的表现。激素抑制炎症细胞，包括巨噬细胞和白细胞在炎症部位的集聚，并抑制吞噬作用、溶酶体酶的释放以及炎症化学中介物的合成和释放。可以减轻和防止组织对炎症的反应，从而减轻炎症的表现。
2、免疫抑制作用：包括防止或抑制细胞介导的免疫反应，延迟性的过敏反应，减少T淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性细胞的数目，降低免疫球蛋白与细胞表面受体的结合能力，并抑制白介素的合成与释放，从而降低T淋巴细胞向淋巴母细胞转化，并减轻原发免疫反应的扩展。可降低免疫复合物通过基底膜，并能减少补体成分及免疫球蛋白的浓度。 取本品约25mg，置25ml量瓶中．加甲醇17ml使溶解，加0.075mol/L醋酸钠缓冲液（pH4.5）（取醋酸钠10.2g，加水溶解并稀释至1000ml，摇匀，用冰醋酸调节pH值至4.5±0.05）稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液:另取醋酸氢化可的松约10mg，置10ml量瓶中，加甲醇7ml使溶解，加0.075mol/L醋酸钠缓冲液（pH4.5）稀释至刻度．摇匀，精密量取1ml与供试品溶液1ml，置同一100ml量瓶中．加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液，照高效液相色谱法（附录Ⅴ D）测定，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-四氢呋喃-0.075mol/L醋酸钠缓冲液（pH4.5）（30:10:60）为流动相，检测波长为242nm，醋酸地塞米松峰与醋酸氢化可的松峰的分离度应大于11.0。
取对照溶液20μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使醋酸地塞米松峰的峰高为满量程的35%-40%。再精密量取供试品溶液与对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。供试品溶液的色谱图中如有杂质峰，单个杂质峰面积不得大于对照溶液中醋酸地塞米松峰面积的1/2；各杂质峰面积的和不得大于对照溶液中醋酸地塞米松峰面积。 供试品用甲醇溶解并稀释成一定浓度的溶液，进入高效液相色谱仪进行色谱分离，用紫外吸收检测器，于波长240nm处检测醋酸地塞米松的吸收值，计算出其含量。
照高效液相色谱法（附录Ⅴ D）测定。 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（70:30）为流动相；检测波长为240nm。理论板数按醋酸地塞米松峰计算不低于1500，醋酸地塞米松峰与内标物质峰的分离度应符合规定。 内标溶液的制备 取甲睾酮，加流动相制成每1ml中的含0.20mg的溶液，即得。 测定法 取醋酸地塞米松对照品约13mg，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇35ml使溶解，用水稀释至刻度，摇匀。精密量取此溶液与内标溶液各5ml，置25ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀；取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图:另取本品适量，同法测定。按内标法以峰面积计算，即得。 1. 甲醇（色谱纯）
2. 水（色谱纯）
3. 甲睾酮 1. 仪器
1.1 高效液相色谱仪
1.2 色谱柱
十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，理论板数按醋酸地塞米松峰计算应不低于1500，醋酸地塞米松与内标物质峰分离度应符合规定。
1.3 紫外吸收检测器
2. 色谱条件
2.1 流动相：甲醇-水= 70 30
2.2 检测波长：240nm
2.3 柱温：室温 1. 对照品溶液的制备
取醋酸地塞米松对照品约13mg，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇35mL使溶解，用水稀至刻度，摇匀，精密量取该溶液与内标溶液各5mL，置25mL量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。
2. 供试品溶液的制备
取本品适量，同上。
3. 内标溶液的配制
取甲睾酮适量，加甲醇制成每1mL中约含0.2mg的溶液，即得。
注：“精密称取”系指称取重量应准确至所取重量的千分之一。“精密量取”系指量取体积的准确度应符合国家标准中对该体积移液管的精度要求。 醋酸地塞米松
Cusuan Disaimisong
Dexamethasone Acetate
书页号：2005年版二部－842
[删去]
【性状】 熔点 本品的熔点（附录Ⅵ C）为223 ～233 ℃，熔融时同时分解。
[增订]
【鉴别】 (5) 在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。
[修订]
【检查】 有关物质 取本品适量，用流动相溶解并稀释制成每1ml中含0.5mg的溶液，作为供试品溶液（临用现制）。取地塞米松对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，精密量取1ml，加供试品溶液1ml，置同一100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照含量测定项下的色谱条件，量取对照溶液20μl，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使醋酸地塞米松峰的峰高约为满量程的30%。供试品溶液的色谱图中如有与对照溶液中地塞米松相应的色谱峰，按外标法以峰面积计算，含量不得过0.5%；其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液中醋酸地塞米松峰面积的1/2（0.5%），各杂质峰面积（与地塞米松相应的杂质峰面积乘以1.13）的和不得大于对照溶液中醋酸地塞米松的峰面积（1.0%）（供试品溶液中任何小于对照溶液醋酸地塞米松峰面积0.01倍的色谱峰可忽略不计）。
【含量测定】 照高效液相色谱法（附录Ⅴ D）测定。
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水(40:60)为流动相，检测波长为240nm。量取有关物质项下的对照溶液20μl注入液相色谱仪，出峰顺序为地塞米松峰、醋酸地塞米松峰，地塞米松峰与醋酸地塞米松峰的分离度应大于20.0。
测定法 取本品适量，精密称定，加甲醇溶解并稀释制成每1ml中约含0.05mg的溶液；精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取醋酸地塞米松对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml中约含50µl的溶液，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。
I. 硝基呋喃衍生原理
硝基呋喃类原型药在生物体内代谢迅速，无法检测。但其代谢产物因和蛋白质结合而保证长时间稳定存在。所以一般以硝基呋喃类药物代谢物为目标分析物的检测，来达到检测硝基呋喃类药物残留量的目的。
检测前处理
在检测前一般需要对样品进行处理，一般分为洗涤、水解和衍生化及净化等处理步骤，下面以国家标准检测方法(GB/T20752-2006)和行业标准方法(SN/T 1627-2005)为例介绍一下检测前处理的一般步骤。
洗涤
GB/T20752-2006:2g均质好的样品，15ml的甲醇-水(2+1)，混匀1min，4000rmp离心，弃掉上清液。
SN/T 1627-2005:1g组织，不用洗涤。
水解和衍生化
GB/T20752-2006:加入20ml 0.2M盐酸，加入0.3ml的衍生化试剂(75mg 2-硝基苯甲醛溶于10ml二甲基亚砜，0.05M)，37℃避光振荡16h。
SN/T 1627-2005:加入30ml 0.125M盐酸，加入1ml的衍生化试剂(100mg 2-硝基苯甲醛溶于12.5ml二甲基亚砜)，37℃避光振荡16h。
净化
GB/T20752-2006:加入5ml 0.1M的磷酸氢二钾，并用1M氢氧化钠调pH到7.4，离心上清液过HLB柱，5ml乙酸乙酯洗脱，40 ℃ 吹干，定容到1ml(10ml乙腈+0.3ml，用水定容到100ml)
SN/T 1627-2005:加入4ml 1M的氢氧化钠，并用1M盐酸和0.1M氢氧化钠调pH到7-7.5，3000rmp离心10min，上清液倒入250ml的分液漏斗中，残渣用5ml水洗， 3000rmp离心10min，上清液也倒入250ml的分液漏斗中，加乙酸乙酯40ml，振摇1ml，静置3min，重复提取1次，合并乙酸乙酯，通过装无水硫酸钠的漏斗过滤至鸡心瓶中，50 ℃ 旋蒸至3-5ml，再转移到试管中， 50 ℃ 吹干，定容至1ml(0.1%乙酸:乙腈:甲醇 3:3:2)。
检测方法
经过对样品检测前的处理后，就可以对样品中的硝基呋喃类药物代谢物残留量进行检测，有关猪肉、禽肉、水产品中硝基呋喃类药物代谢残留量测定的方法，国家有相应的检测标准，也有相关的行业标准，另外文献报道也有一些检测方法。国家和行业标准检测方法基本是液相色谱法或液相色谱-串联质谱法，区别在于提取溶液和净化方法上有差异，以及外标法或内标法定量的不同，检出限大多为0.5ug/kg。文献报道有固相萃取液相色谱-质谱法和液相色谱-串联质谱组合法，其中前者与国家、行业标准检测方法的检出限相同，后者检出限能达到0.03 ug/kg。
J. 如何用液相色谱仪测氨基酸
反相高效液相色谱法测定烟叶中的游离氨基酸
氨基酸是烟草中的一类重要化学物质，在烟草调制、醇化或发酵、加工直至燃烧过程中，游离氨基酸与还原糖之间可发生酶催化及非酶催化的棕色化反应，生成多种具有蒸煮、烤香、爆米花香味特征的吡喃、吡嗪、吡咯、吡啶类等杂环化合物，某些氨基酸如苯丙氨酸还可自身分解成香味化合物，如苯甲醇、苯乙醇等。氨基酸含量与烟草制品的吃味有着密切的关系，氨基酸在燃烧裂解过程中一般形成具有刺激性的含氮化合物，对烟气香吃味产生不良影响，个别氨基酸还产生HCN等危害健康的烟气成分。一般说来，氨基酸含量太高，烟气辛辣、味苦、刺激性强烈；含量太低时烟气则平淡无味缺少丰满度。因此对氨基酸的分析是一项很有意义的工作，二十世纪60年代以来，国内外在这方面做了大量的工作[1-5]。
植物游离氨基酸样品的制备，国内外采用的提取剂和纯化方法各不相同。据文献报道[6-7]，盐酸、不同浓度的乙醇溶液均可以用来提取植物组织中的游离氨基酸；提取液纯化则有用阳离子交换树脂、5%磺基水杨酸、活性炭或乙醚等方法。本实验对不同的提取方式和不同的纯化方法进行了对比研究，确定提取烟叶中游离氨基酸的较佳提取剂和纯化方法。提取、纯化后的样品，采用OPA、FMOC联合柱前衍生反相高效液相色谱法对烟叶中的游离氨基酸进行了测定。该方法使带氨基和亚氨基基团的氨基酸能够被同时测定，且得到较好的定性定量结果。
1 实验
1.1 仪器
Agilent公司HP1100型高效液相色谱仪(带可变波长紫外检测器和自动进样器)，PE公司Lambda Bio40 紫外-可见分光光度计。
1.2 试剂
正缬氨酸（Norvaline，内标），OPA ，FMOC，均为色谱纯，Agilent公司提供；硼酸缓冲溶液，Agilent公司提供；
醋酸钠(NaAc)，分析纯，中国医药（集团）上海化学试剂公司；三乙胺（TEA），四氢呋喃（THF），乙腈（CH3CN），甲醇(MeOH)，均为色谱纯，Fisher公司试剂；
氨基酸标样包括：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）、丝氨酸（Ser）、组氨酸（His）、甘氨酸（Gly）、苏氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、胱氨酸（Cys）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro），均为生化试剂，中国医药（集团）上海化学试剂公司；
苯乙烯阳离子交换树脂（732型），天津树脂厂。
1.3 样品处理
将烟叶在烘箱中恒温40℃烘干至恒重，粉碎，过80目筛，筛下物为实验用烟样粉末，置于广口瓶中备用。准确称取烟样粉末1.000g于干燥的洁净试管中，用一定浓度的乙醇溶液室温超声波提取半小时，过滤，相同浓度的乙醇溶液洗涤，再提取一次，合并后的滤液用阳离子交换柱洗脱，然后用95ml 4mol/L氨水淋洗阳离子交换柱，淋洗液恒温浓缩至干，最后用3ml 0.1mol/L稀盐酸溶液溶解浓缩物，将此溶液离心分离20min，0.45μm微孔滤膜过滤，加入浓度为5nmol/μ1的内标10μ1，定容至50ml，HP1100液相色谱仪进行氨基酸分析。
样品自动柱前衍生化：Agilent公司G1313A自动进样器进样。程序为：吸取5μl硼酸缓冲液，再吸取1μ1 OPA试剂，洗针一次，吸取样品2μl，原位混合6次。吸取1μl FMOC试剂，洗针一次，原位混合3次，进样。
1.4 色谱条件
色谱柱：Hypersil AA-ODS C18 2.1×200mm
流动相A：1.36±0.025g醋酸钠，加入500ml纯水溶解，加90μl三乙胺，用1%醋酸调pH=7.20±0.05，再加入1.5ml四氢呋喃，混合均匀。
流动相B：1.36±0.025g醋酸钠，加入100ml纯水溶解，用1%醋酸调pH=7.20±0.05，将此溶液加至200ml乙腈和200ml甲醇的混合物中，并混合均匀。
流速：0.45ml/min
柱温：40℃
紫外检测波长: 0～16min， 338nm； 16～25min，262nm
淋洗梯度：见表1
表1 流动相的淋洗梯度表
Table 1 The gradient time table of mobile phase
序列 时间（min） 流动相A（%） 流动相B（%） 流速（ml/min）
1 0.00 100.0 0.0 0.450
2 15.50 40.0 60.0 0.450
3 18.00 0.0 100.0 0.450
4 21.00 0.0 100.0 0.800
5 23.90 0.0 100.0 0.800
6 24.00 0.0 100.0 0.450
7 25.00 100.0 0.0 0.450
1.5 氮基酸的定性
用标样色谱图、文献参照和标样加入的方法，通过对照保留时间进行定性，对氨基酸的出峰顺序加以确认。
1.6 内标法定量
准确移取浓度为10 pmol/μ1、25 pmol/μ1、50 pmol/μ1、100 pmol/μ1、250 pmol/μ1、500 pmol/μ1、1000 pmol/μ1的氨基酸混合标样100μl于带内衬管的样品瓶中，再加入250pmol/μ1内标溶液100μl，充分混合，液相色谱分析，仪器自动计算各氨基酸的标准曲线。
2 结果与讨论
2.1 萃取溶剂的比较
氨基酸可溶解于水、乙醇、甲醇、稀酸等，因此它们均可作为烟叶中游离氨基酸的萃取溶剂，传统的方法是用乙醇和0.1mol/L的盐酸。实验发现，乙醇和0.1mol/L的盐酸萃取方法比较，提取出的烟叶中的游离氨基酸的总量变化不大，但用盐酸提取的样品分析时RSD%较大，平均8.51%，其中超过10%的有4个，甘氨酸的RSD%最大为20%；而用乙醇提取的样品分析时RSD%相对较小，平均5.12%，超过10%的只有1个。而且盐酸提取液过滤速度慢，需要30-40min，而乙醇提取液过滤只需10min左右；因此，本实验选择乙醇作为烟叶中游离氨基酸的萃取溶剂。
2.2 乙醇浓度的选择
选择五种不同浓度的乙醇溶液进行了烟样中游离氨基酸的提取，测定不同条件下提取液中游离氨基酸的总量，结果如图1。图中显示，在乙醇溶液浓度为80%时，烟样中总游离氨基酸的提取量最大。而且不同浓度下游离氨基酸的RSD%没有明显的变化，因此，选择80%的乙醇溶液来进行烟样中游离氨基酸的提取。
2.3 不同纯化方法的确定
在最佳乙醇溶液浓度下，分别用活性炭加入提取液吸附杂质、乙醚加入提取液萃取分离杂质、5%磺基水杨酸加入提取液沉淀去除杂质和阳离子交换树脂吸附杂质四种方法进行了纯化实验。结果发现，活性炭作为纯化剂时其色谱图中杂质峰较少，但同时氨基酸峰亦有多个消失，主要是因为活性炭对氨基酸也有较强的吸附，它在吸附杂质的同时也吸附了需要检测的氨基酸，故活性炭不适合作为纯化剂使用。乙醚和5%磺基水杨酸作为纯化剂时，杂质去除不完全，其色谱图均表现为杂质峰较多，湮没了大量氨基酸峰，且基线漂移严重，给定性定量工作带来困难。当用阳离子交换树脂进行纯化时，其色谱图中杂质峰较少，基线平稳，氨基酸峰分离较好，均可以进行定性和定量分析，故本实验选择了阳离子交换树脂作为纯化手段。
2.4 色谱分离
2.5 线性范围及标准曲线
分别取浓度为10 pmol/μ1、25 pmol/μ1、50 pmol/μ1、100 pmol/μ1、250 pmol/μ1、500 pmol/μ1、1000 pmol/μ1的氨基酸混合标样加入等体积的250 pmol/μ1的内标溶液，进行HPLC分析，以氨基酸浓度为横坐标，氨基酸与内标的面积比为纵坐标，得到各个氨基酸的标准曲线，如表2所示。从表中可以看出，各氨基酸在10-1000 pmol/μ1的浓度范围内均有良好的线性，各氨基酸标准曲线的线性相关系数均大于0.99。
表2 氨基酸的标准曲线
Table 2 Standard curves of 17 amino acids
氨基酸 线性方程 相关系数
Asp Y=0.007037x+0.004689 0.9972
Glu Y=0.007520x+0.005375 0.9961
Ser Y=0.006903x+0.038212 0.9988
His Y=0.003719x+0.020168 0.9945
Gly Y=0.005851x+0.018235 0.9966
Thr Y=0.006932x+0.021072 0.9978
Ala Y=0.006275x+0.015314 0.9912
Arg Y=0.006088x+0.016113 0.9920
Tyr Y=0.006734x+0.015022 0.9993
Cys Y=0.006004x+0.009876 0.9985
Val Y=0.006432x+0.009932 0.9927
Met Y=0.006574x+0.010346 0.9905
Phe Y=0.005098x+0.019023 0.9962
Ile Y=0.005976x+0.016235 0.9953
Leu Y=0.006044x+0.015332 0.9964
Lys Y=0.006833x+0.010437 0.9969
Pro Y=0.022455x+0.009376 0.9922
2.6 重现性实验
取云南C2F99烟样做平行实验（n=5），进行烟叶中游离氨基酸含量的检测，结果发现： Asp和 Glu含量的RSD%分别为8.0%和8.6%，这可能是二者的分离度不高引起的；His的RSD%为9.0%，这可能与其含量较低，分离效果不好有关。其它氨基酸含量的RSD%均处在3%～7%。
2.7 回收率实验
用标样加入法进行回收率实验，结果见表3。 Thr的回收率仅为68.0%，原因可能与其含量较少有关；其它15种氨基酸的回收率在81.0%～110.5%，平均回收率为93.9%，说明该方法的回收率结果令人满意。
表3 分析方法的回收率
Table 3 Recovery percents of the analytical method
氨基酸 加入量（mg/g烟样） 样品含量（mg/g烟样） 测定值（mg/g烟样） 差值（mg/g烟样） 回收率%
Asp 0.200 0.320 0.499 0.179 89.5
Glu 0.200 0.309 0.484 0.175 87.5
Asn 0.200 0.986 1.208 0.222 110.0
Ser 0.200 0.172 0.334 0.162 81.0
Gln 0.200 0.186 0.368 0.182 91.0
His 0.200 0.106 0.297 0.191 95.5
Gly 0.200 0.064 0.279 0.215 107.5
Thr 0.200 0.052 0.188 0.136 68.0
Ala 0.200 0.642 0.835 0.193 96.5
Arg 0.200 0.266 0.463 0.197 98.5
Val 0.200 0.090 0.259 0.169 84.5
Phe 0.200 0.218 0.406 0.188 94.0
Ile 0.200 0.026 0.191 0.165 82.5
Leu 0.200 0.028 0.199 0.171 85.5
Pro 0.200 1.432 1.653 0.221 110.5
Tyr 0.200 0.062 0.245 0.183 91.5
2.8 样品分析
利用该方法对不同等级的烟叶中游离氨基酸的含量进行了分析，结果见表4。从表中可以看出，在所分析的样品中，烤烟烟叶中含量最高的氨基酸是Pro，白肋烟烟叶中含量最高的氨基酸是Asp和Asn；白肋烟烟叶中氨基酸的含量高于烤烟烟叶；相同等级的烤烟烟叶，云南烟叶中的氨基酸含量高于其它产区。
表4 不同等级烟叶中游离氨基酸的含量（mg/g烟样）
Table 4 Amounts of free amino acids in different
grade tobacco leaves（mg/g tobacco leaves）
氨基酸 云南烤烟C1F 云南烤烟C2F 云南烤烟C1L 云南烤烟B1F 云南烤烟B2F 福建烤烟B1F 福建烤烟C1F 四川烤烟C1F 四川烤烟B1F 贵州烤烟C1F 贵州烤烟B1F 贵州烤烟C1L 鄂西白肋中一 鄂西白肋中二
Asp 0.24 0.31 0.60 0.40 0.38 0.37 0.26 0.37 0.26 0.26 0.32 0.35 1.73 1.59
Glu 0.36 0.32 0.21 0.17 0.16 0.11 0.15 0.20 0.30 0.32 0.29 0.25 0.54 0.61
Asn 0.91 0.34 1.50 0.95 0.38 0.18 0.25 0.35 0.32 0.44 0.55 0.48 7.70 7.62
Ser 0.16 0.10 0.18 0.16 0.10 0.12 0.24 0.21 0.19 0.20 0.19 0.15 0.62 0.58
Gln 0.19 0.05 0.22 0.17 0.04 0.06 0.10 0.11 0.10 0.11 0.15 0.10 0.18 0.20
His 0.11 0.02 0.14 0.10 0.06 0.06 0.11 0.09 0.07 0.09 0.08 0.09 0.20 0.22
Gly 0.10 0.09 0.19 0.17 0.07 0.08 0.12 0.15 0.12 0.15 0.13 0.12 0.16 0.19
Thr 0.05 0.05 0.08 0.06 0.05 0.04 0.08 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.19 0.16
Ala 0.65 0.55 0.84 0.69 0.54 0.51 0.65 0.59 0.55 0.48 0.53 0.70 0.57 0.55
Arg 0.29 0.21 0.32 0.28 0.18 0.26 0.32 0.28 0.25 0.33 0.29 0.33 0.48 0.42
Tyr 0.06 0.07 0.06 0.07 0.06 0.05 0.07 0.05 0.06 0.06 0.07 0.06 0.10 0.15
Val 0.10 0.10 0.12 0.11 0.10 0.14 0.15 0.13 0.12 0.15 0.14 0.13 0.21 0.25
Met 0.07 0.07 0.09 0.08 0.06 0.06 0.08 0.08 0.08 0.07 0.09 0.08 0.12 0.13
Phe 0.26 0.12 0.28 0.23 0.10 0.21 0.25 0.21 0.25 0.28 0.30 0.33 0.44 0.59
Pro 1.14 0.83 2.13 1.51 0.69 0.66 1.03 1.23 1.11 1.32 1.18 1.09 0.25 0.35
总量 4.69 3.23 6.96 5.15 2.97 2.91 3.86 4.14 3.86 4.33 4.37 4.31 13.49 13.61
3 结论
本烟叶中游离氨基酸的分析方法采用80%的乙醇作为萃取溶剂，阳离子交换树脂对提取液进行纯化，能够最大程度地提取烟叶中的游离氨基酸并较好地去除了影响氨基酸测定的杂质，使色谱图中杂质峰较少；OPA、FMOC联和柱前衍生使带氨基和亚氨基基团的氨基酸同时得到测定；良好的梯度洗脱使各个氨基酸峰得到较好的分离，并使定量结果更加可靠。