1. RNA琼脂糖凝胶电泳时为什么点样孔很亮，而且没有规律，时有时无，每次都是新胶及新的缓冲液请各位帮忙
这是因为你RNA中含有蛋白或者多糖的污染，这些大分子物质影响了RNA的出孔，使很多RNA停留在孔中或者出孔很慢。这样你染色后就看到孔以及接近孔的位置很量。你最好上样前用分光光度计测下RNA的纯度，A260/280和A260/230，这两个值应该都在2.0左右才是纯度高的RNA。第一个值过低是蛋白污染，第二个值过低是多糖污染。
2. 电泳液碱性高是怎么造成的
首先你是琼脂糖凝胶电泳还是SDS-PAGE蛋白电泳，
琼脂糖凝胶电泳用 0.5xTBE或1xTAE，配方含有Tris电泳液是碱性的。
原理
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。
琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。
蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。
2、SDS-PAGE 蛋白电泳
原理
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量
用的是Tris-甘氨酸缓冲液。
不知你的问题出在哪，有这方面问题可以问我，祝你实验顺利。
3. EMSA实验步骤
一、探针的标记
如下设置探针标记的反应体系：
（1）待标记探针 (1.75 pmol/μl) ：2μl
（2）T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) ：1μl
（3）Nuclease-Free Water ：5μl
（4）[γ-32P]ATP(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml) ：1μl
（5）T4 Polynucleotide Kinase (5-10 u/微升) ：1μl
（6）总体积：10μl
（7）按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混匀。
使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。
加入1μl 探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。
再加入89μl TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上，即总放射性的30%以上标记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。
标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。
二、 探针的纯化
通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化，可以按照如下步骤操作
对于100μl 标记好的探针，加入1/4体积即25μl 的5 M醋酸铵，再加入2体积即200μl 的无水乙醇，混匀。
在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。
在4℃，12 000 g-16 000 g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉。
在4℃，12 000 g-16 000 g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。
加入100μl TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在 -20℃。
三、EMSA 胶的配制
准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大 EMSA 胶的模具。
按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。
（1）TBE buffer (10X)： 1ml 重蒸水：16.2ml
（2）39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v)： 2ml
（3）80% 甘油： 625μl
（4）10% 过硫酸铵 (ammonium persulfate) ：150μl
（5）TEMED ：10μl
按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡， 并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。
四、EMSA结合反应
如下设置EMSA结合反应
阴性对照反应：
（1）Nuclease-Free Water ：7μl
（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2μl
（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子： 0μl
（4）标记好的探针 ：1μl
（5）总体积 ：10μl
样品反应：
（1）Nuclease-Free Water ：5μl
（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2μl
（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子 ：2μl
（4）标记好的探针： 1μl
（5）总体积： 10μl
探针冷竞争反应：
（1）Nuclease-Free Water ：4μl
（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2μl
（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子： 2μl
（4）未标记的探针： 1μl
（5）标记好的探针： 1μl
（6）总体积 ：10μl
突变探针的冷竞争反应：
（1）Nuclease-Free Water ：4μl
（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2μl
（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子 ：2μl
（4）未标记的突变探针： 1μl
（5）标记好的探针： 1μl
（6）体积 ：10μl
Super-shift反应：
（1）Nuclease-Free Water：4μl
（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2μl
（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子：2μl
（4）目的蛋白特异抗体 ：1μl
（5）标记好的探针：1μl
（6）总体积 ：10μl
按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25℃)放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25℃)放置20分钟。
加入1μl EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建
议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可。
五、 电泳分析
用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1X 的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。
把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液 (蓝色)，用于观察电泳进行的情况。
按照10 V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓 冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。
剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板，用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边
缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注：通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板)，把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶，轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟)，轻轻揭起滤纸，这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下，放平，在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。
干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测，或用其它适当仪器设备检测。
4. 电泳实验中什么叫上样缓冲液
loading buffer 的中文名字叫上样缓冲液，6kb的缓冲液中可以显示两条带，前面的紫蓝色的条带是溴酚蓝，在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同。
后面的蓝色条带是二甲苯氰，它在1%和1.4%琼脂糖中电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似。而对于PAGE胶他们的迁移速率也分别不同。
将等式同时取对数，并简化就可以得到：
这就是Henderson-Hasselbalch方程。
值得注意的是，式子中酸及其共轭碱的浓度都是平衡时的浓度，除了酸性过于强的情况下，由于同离子效应的存在，一般都可用此式计算，
根据此式可得出下列几点结论：
1、缓冲液的pH值与该酸的电离平衡常数Ka及盐和酸的浓度有关。弱酸的pKa值衡定，但酸和盐的比例不同时，就会得到不同的pH值。酸和盐浓度相等时，溶液的pH值与PKa值相同。
2、酸和盐浓度等比例增减时，溶液的pH值不变。
3、酸和盐浓度相等时，缓冲液的缓冲效率为最高，比例相差越大，缓冲效率越低，缓冲液的一般有效缓冲范围为pH=pKa±1,pOH=pKb±1。
配制方法
只要知道缓冲对的PH值，和要配制的缓冲液的pH值（及要求的缓冲液总浓度），就能按公式计算[盐]和[酸]的量。这个算法涉及对数换算，较麻烦，前人为减少后人的计算麻烦，已为我们总结出pH值与缓冲液对离子用量的关系并列出了表格。
只要我们知道要配制的缓冲液的pH，经查表便可计算出所用缓冲剂的比例和用量。例如配制500nm pH5.8浓度为0.1M磷酸缓冲液。
经查表知pH5.8浓度为0.2M Na2HPO48.0毫升（1M=1 mol/L），而0.2M Na2HPO492.0毫升。依此可推论出配制100ml 0.1M的磷酸缓冲液需要0.1M Na2HPO48.0毫升，而0.1M Na2HPO4需要92.0毫升。
计算好后，按计算结果准确称好固态化学成分，放于烧杯中，加少量蒸馏水溶解，转移入50ml容量瓶，加蒸馏水至刻度，摇匀，就能得到所需的缓冲液。
各种缓冲溶液的配制，均按表格按比例混合，某些试剂，必须标定配成准确浓度才能进行，如醋酸、氢氧化钠等。另外，所有缓冲溶剂的配制计量都能从以上的算式准确获得。
参考资料来源：网络-缓冲溶液
参考资料来源：网络-上样缓冲液
5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳跑DNA 电泳缓冲液可以用1XTAE代替1XTBE吗
是这样的，TAE和TBE都能用来跑电泳，TAE用的比较广泛！他俩的区别是：TAE: 缓冲容量小，但是溶解性能好，可以配成高浓度储备液，使用方便；TBE: 缓冲容量大，可以较长时间再换一次，但是溶解性不好，通常只配.....2X 储备液，或者直接用粉剂配，使用不方便。………………… …………………… 详细资料请参考： TBE聚丙烯酰胺凝胶(电泳) ： http://proct.bio1000.com/100022/
6. 凝胶迁移实验（EMSA） 的原理及实验方案详解
对于新手小白做这些大实验时可能不知所措，为了方便学习，将相关实验进行归纳总结:
凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
需要两个试剂盒 碧云天（GS008 GS009）:一个用于生物素标记 ，一个用于凝胶迁移实验
配备TBE缓冲液可以配置成 5× 或者 10×的储液。
10x TBE 储液配制方法：
将Tris（FW=121）108g，硼酸（FW=61.8）55g，40 ml 0.5 M EDTA 溶解在600 ml的去离子水中；而后调节pH至8.3，加去离子水定容至1L后，室温保存。使用时稀释10倍 即为1×TBE Buffer。
（1）设计重组引物TF-F，R，进行PCR扩增，PCR产物纯化回收。
（2）使用NEB限制性内切酶将pet28a载体线性化，并进行纯化回收。
（3）利用重组试剂盒进行重组反应(Vazyme, C112-02）。
（4）将反应体系加入DH5α感受态中，进行转化，涂板，挑斑检测。挑选阳性菌液过夜培养，提质粒，-20℃保存备用。
参照康为世纪试剂盒：His-tag 标签蛋白纯化试剂盒（可溶性蛋白）
（1）使用1xTEN buffer溶解单链探针，将互补的单链探针按1:1混匀。
（2）95℃加热10分钟，自然降温到15-25℃。
（3）取出退火探针，加入适量的1 x TEN buffer稀释浓度至3-4pmol/ µl.。
（4）将100ng退火探针置于无酶的PCR管中，加去ddH2O补至10 µl。
（5）按以下体系将各组分混合，37℃孵育30分钟
a. 参考上表设置反应体系。注：对于双链的EMSA探针的标记反应，建议一次做两管，即总体积共100µl，以最终获得足够的生物素标记EMSA探针用于后续EMSA检测。
b. 用枪轻轻吹打混匀，切勿vortex。37ºC孵育30分钟。
c. 加入2.5µl 探针标记终止液，轻轻混匀终止反应。
a. 探针标记反应终止后，加入52.5µl氯仿-异戊醇(24:1)，vortex使有机相和水相充分混合以抽提TdT(说明：静止后有机相和水相会很快分层)。
b. 12000-14000g离心1-2分钟。吸取上清备用。上清即为被生物素标记的单链DNA探针。
通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。有些时候，纯化后的探针会改善后续实验的结果。如需纯化，可以按照如下步骤操作：
a. 对于100µl标记好的探针，加入1/4体积即25µl的5M醋酸铵，再加入2体积即200µl的无水乙醇，混匀。
b. -70ºC至-80ºC沉淀1小时，或-20ºC沉淀过夜。
c. 4ºC，12,000g-16,000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉淀。
d. 4ºC，12,000g-16,000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。 e. 加入50µl TE，完全溶解沉淀。标记好的探针可以-20ºC保存。
a. 取5µl Biotin-Control Oligo (0.4µM)，加入196µl TE，混匀，稀释成10nM Biotin-Control Oligo(作为标准品)。取出适量10nM Biotin-Control Oligo，依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。
b. 取3µl步骤3B所获得的生物素标记的DNA探针(100nM)，加入27µl TE，混匀，稀释成10nM 生物素标记的探针(作为待测样品)。取出适量的10nM 生物素标记的探针，依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。
c. 参考下面的表格，取一适当大小的带正电荷尼龙膜，在膜上做好相应标记。对于经过梯度稀释的标准品和待测样品，分别取2µl滴加到膜上。在膜上滴加标准品或待测样品时，请注意使液滴充分被膜吸收，在膜上形成一个湿的圆形小斑点。说明：如果条件许可，可以使用专门用于点杂交或狭缝杂交的设备进行探针标记效率的检测，探针的用量参考下表，浓度可以再稀释50倍，而所用体积可以相应放大50倍至100µl。
a. 对于步骤2B标记好的单链DNA探针，把正义链和反义链等体积混合(不可根据标记效率调整摩尔比例)。对于最初使用变性的双链EMSA探针进行探针标记的情况，直接进入下一步。
b. 加入退火缓冲液(10X)，使退火缓冲液的最终浓度为1X，混匀。例如待退火探针的体积为100微升，则加入11微升退火缓冲液(10X)。
c. 如下设置PCR仪进行退火反应：
注1：如果所用的PCR仪不具备下降0.1ºC的功能，也可以设置为每90秒下降1ºC。
d. 退火反应结束后，-20ºC保存标记好的EMSA探针。此时的EMSA探针已经可以直接用于后续的EMSA检测，也可以对探针进行适当纯化后再进行EMSA检测。
a. 准备好倒胶的模具。可以使用常规的制备蛋白电泳胶的模具(例如BioRad的常规用于蛋白电泳的制胶装置)，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大EMSA胶的模具。制胶前必须把制胶模具冲洗干净，需特别注意不能有SDS残留。
b. 按照如下配方配制20ml 4%的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。
注意：此实验中需去除SDS变性剂
c. 按照上述顺序依次加入各种试剂，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡，并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理
b. 按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25ºC)放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25ºC)放置20分钟。
c. 加入1µl EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至可以观察到蓝颜色即可。
a. 用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1X的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。
b. 把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10µl稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色)，用于观察电泳进行的情况。
c. 按照10V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30ºC，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。
a. 取一和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜，剪角做好标记，用0.5XTBE浸泡至少10分钟。尼龙膜自始至终仅能使用镊子夹取，并且仅可夹取不可能接触样品的边角处。
b. 取两片和尼龙膜大小相近或略大的滤纸，用0.5XTBE浸湿。
c. 把浸泡过的尼龙膜放置在一片浸湿的滤纸上，注意避免尼龙膜和滤纸间产生气泡。
d. 非常小心地取出EMSA胶放置到尼龙膜上，注意确保胶和膜之间没有气泡。
e. 再把另外一片浸湿的滤纸放置到EMSA胶上，注意确保滤纸和胶之间没有气泡。 碧云天/Beyotime 400-1683301/800-8283301 GS009 化学发光法EMSA试剂盒 3 / 5
f. 采用Western时所使用的湿法电转膜装置或其它类似的电转膜装置，以0.5XTBE为转膜液，把EMSA胶上的探针、蛋白以及探针和蛋白的复合物等转移到尼龙膜上。对于大小约为10x8x0.1cm的EMSA胶，用BioRad的常用的Western转膜装置，电转时可以设置为380mA(约100V)转膜30-60分钟。如果胶较厚，则需适当延长转膜时间。转膜时需保持转膜液的温度较低，通常可以把电转槽置于4ºC冷库或置于冰浴或冰水浴中进行电转，这样可以确保低温。具体的电转膜方法请参考电转膜装置的使用说明。
g. 转膜完毕后，小心取出尼龙膜，样品面向上，放置在一干燥的滤纸上，轻轻吸掉下表面明显的液体。立即进入下一步的交联步骤，不可使膜干掉。
a. 用紫外交联仪(UV-light cross-linker)选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联45-60秒(根据经验，建议交联30min)。如果没有紫外交联仪可以使用普通的手提式紫外灯(例如碧云天的手提紫外检测仪(EUV002))，距离膜5-10厘米左右照射3-10分钟。也可以使用超净工作台内的紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射3-15分钟。最佳的交联时间可以使用标准品自行摸索。
b. 交联完毕后，可以直接进入下一步检测；也可以用保鲜膜包裹后在室温干燥处存放3-5天，然后再进入下一步检测。
c. 如果检测结果发现交联效果不佳，甚至连free probe的条带都非常微弱，可以考虑在膜干燥后参考步骤A的条件再交联一次，以进一步改善交联效果。
a. 37-50ºC水浴溶解封闭液和洗涤液。 注意：封闭液和洗涤液必须完全溶解后方可使用，封闭液和洗涤液可以在室温至50ºC之间使用，但必须确保这两种溶液中均无沉淀产生，在冬天需特别注意。
b. 取一合适的容器加入15ml封闭液，再放入交联过的含有样品的尼龙膜。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。
c. 取7.5µl Streptavidin-HRP Conjugate加入到15ml封闭液中(1:2000稀释)，混匀备用。
d. 去除用于尼龙膜封闭的封闭液，加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRP Conjugate的封闭液。在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。
e. 取25ml洗涤液(5X)，加入100ml重蒸水或Milli-Q级纯水，混匀配制成125ml洗涤液。
f. 将尼龙膜转移至另一装有15-20ml洗涤液的容器内，漂洗1分钟。
g. 去除洗涤液，加入15-20ml洗涤液，在侧摆摇床或水平摇床缓慢上洗涤5分钟。
h. 重复步骤G 三次(共洗涤四次)，每次洗涤时间都约为5分钟。
i. 将尼龙膜转移至另一装有20-25ml检测平衡液的容器内，在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动5分钟。
j. 取5ml BeyoECL Moon A液和5ml BeyoECL Moon B液混匀，配制成BeyoECL Moon工作液。注意：BeyoECL Moon工作液必须现配现用。说明：从本步骤起操作方法和注意事项同Western实验的荧光检测。
k. 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。立即将膜的样品面向上，放置到处于水平桌面上的洁净容器内或保鲜膜上。
l. 在尼龙膜的表面小心加上步骤J配制好的共10ml BeyoECL Moon工作液，使工作液完全覆盖尼龙膜。室温放置2-3分钟。
m. 取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。将尼龙膜放在两片保鲜膜或其它适当的透光薄膜中间，并固定于压片暗盒(也称片夹)内。
n. 用X光片压片1-5分钟。可以先压片1分钟，立即显影定影，然后根据结果再调整压片时间；也可以直接分别压片30秒、1、3、5分钟或更长时间，然后一起显影定影观察结果。
7. 聚丙烯酰胺凝胶电泳跑DNA 电泳缓冲液可以用1XTAE代替1XTBE吗
具体不太清楚，只知道如果是琼脂糖电泳，用TAE，PAGE用TBE跑DNA
8. DNA重组的质粒载体中的快速克隆
质粒克隆中最慢的步骤是所需的外源DNA片段和相应质粒DNA区段的电泳纯化，下面的操作方案[由S.Michaelis(个人通讯）根据Struhl(1985)的方法修订而成]是从纯化的凝胶中回收琼脂糖块，熔化后直接进行质粒和外源DNA的连接。这一方法寻平端连接和粘端连接都同样奏效，但需大量的连接酶，而且效率要比标准操作方案约低一个数量级。
1）用适当的限制酶消化外源DNA，其量应足以产生约0.2μg的靶片段。反应体积应为20μl或更小。在另一管中，用相应的限制酶消化约0.5μg载体DNA，总反应体积为20μl或更小。如载体DNA带相同的端，应用磷酸处理如下：用限制酶消化完全后，加2.5μl 100mmol/L (pH8.3)、10mmol/L ZnCl2,加0.25单位牛小肠碱性磷酸酶，于37℃温育30分钟。
2）通过琼脂糖凝胶电泳分离目标片段。务必用低熔点琼脂糖灌制凝胶，务必用含溴化乙锭（0.5μg/ml）的1xTAE作为电泳缓冲液而不是常规的0.5xTBE来配制凝胶并进行电泳。
3）在长波长紫外照射下检查凝胶，根据目标条带的相对荧光强度估计所含DNA的量（见附录E）。用刀片切出目标条带，尽可能少琼脂糖的体积（通常40-50μl)。将切下凝胶片分别放入作好标记的各个微量离心管中。
4）于70℃加热10-15分钏，使琼脂糖熔化。
5）合并熔化的小份凝胶并放到加温至37℃的中一管中，共终体积应不超过10μl,外源DNA与质粒载体的摩尔比应接近2：1。
用另外两个管设立两个对照连反应，一个只含质粒载体，另一个只含外源DNA片段。
6）将3个管于37℃温育5-10分钟，然后每管加10μl用冰预次的2xT4噬体DNA连接酶混合物，在琼脂糖凝固前，充他混匀各管内容物，于16℃温育12-16小时。
2xT4噬菌体DNA连接酶混合物可制备如下：
1mol/L <cite class="highlight" highlight="true"></cite>(pH7.6) 1.0μl
100mmol/L氯化镁 1.0μl
200mmol/L三硫苏糖醇 1.0μl
10mmol/L ATP 1.0μl
水 5.5μl
T4噬菌体DNA连接酶 1Weiss单位
混匀后放置于冰浴上。
7）连接反应行将结束时，取出贮存于-70的3管各200μl的冻存大肠杆菌感受态细胞
8）于70℃中热10-15分钟重新溶化连接混合物中的琼脂糖。
9）立即从每管连接混全物中取出5μl加到200μl大肠杆菌感受态细胞中，小心摇晃，快速地混匀内容物。从剩下每管连接混合物中分别再取5μl重复以上步骤，将转化混合物在冰浴上放置30分钟。
10）完成转化方案的其余各步。