㈠ 稀有密码子分析工具 1对1
手头上的蛋白质表达不顺利，想做一下密码子优化，但是网站只给出CAI一个指标，并没有具体给出哪些密码子不利于表达。遍寻网站，很多密码子分析工具里没有链霉菌这个选项，遂用google 搜索，找到了SMS这个网站。兹对此工具做简单介绍，需者自取。
SMS（sequence manipulation suite） 里边有很多DNA分析工具
这里使用 codon plot 对密码子偏好性进行分析
1，在上方输入自己的FASTA序列
2，根据目标宿主的密码子偏好性，输入 GCG 格式的密码子表（点击网页中的 codon usage database 链接，查找宿主，在 Format 里选择 standard/eubacterial ，并点选第二个复选框输出GCG格式，返回原网页，复制粘贴，点submit即可）
3，弹出新的对话窗口，自己分析
㈡ 密码子优化
在大肠杆菌中进行异源蛋白质的表达时，有时会发现重组蛋白质的表达量很低，给后面的分离纯化造成很大的困难。有些技术人员可能比较困惑，表达的蛋白质不是毒蛋白，载体是商用载体，一般商用载体的启动子效率都很高，这也排除了转录水平低的问题。那为什么蛋白质表达水平还那么低，这种情况你就要考虑是不是密码子偏性的问题。
什么是密码子偏性呢？可以这么理解，宿主经过千百万年的进化，密码子与反密码子之间已经形成了一个平衡，有些密码子出现的频率高，其对应的tRNA水平也就高，密码子频率低对应的tRNA水平也就低。如果插入的外源基因上携带大量在宿主中频率很低的密码子，那么对应的tRNA就会出现不够用的情况，宿主首先要保证自身的蛋白质合成，剩下的才能用于异源蛋白质的合成，虽然宿主可以提高tRNA的水平，但对于异源蛋白质来说，合成的晚了或者慢了，就会引起翻译过程一系列的连锁减慢，合成的效率就会严重下降。
基于这一原理，要提高某一基因在异源宿主中的表达量，常用的策略之一就是将目的基因的稀有密码子进行同义替换，使之更接近于宿主细胞的密码子使用方式。通过这种方法，提高外源基因在大肠杆菌宿主中表达量的报道已有很多。
我这里制作了一个大肠杆菌所有密码子偏好的数据集，表中RSCU代表该密码子在所有同意密码子中的相对概率，计算方法为 : [该密码子出现频率] / [同义密码子概率的和] × 同义密码子个数 。可以根据密码子RSCU判断其偏性，进行密码子替换时，将RSCU值低的密码子替换成值高的密码子即可提高异源蛋白的表达量。
同时，也给出两个做密码子优化的网页工具： OPTIMIZER 和 Jcat 。Optimizer进行密码子优化时会考虑GC含量、密码子平衡（如果将全部低频密码子换成最高频密码子，会导致细菌表达压力过大，不利于自身生长，这也是不行的），还可行规避酶切位点，自己指定参考集等，功能强大，推荐使用该工具。Jcat简单粗暴，直接将低频密码子替换成高频密码子。如果你只有蛋白质序列可以使用我自己编写的一个工具： http://www.liuzhen106.com/tools/103_2.html 。
什么进化压力导致了密码子使用偏性，还没有定论。一些研究者推断，密码子偏性能够减少同工tRNAs的多样性，一些稀有密码子的tRNAs含量较少，有利于生物在快速生长条件下节约部分能量，从而降低了新陈代谢负荷。不管是什么原因导致了密码子偏性，但密码子偏性对异源蛋白表达水平确有深远的影响。
㈢ 什么是稀有密码子稀有密码子的的功能
遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。那些被最频繁利用的称为最佳密码子(optimal codons)，那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子(rareorlow-usage codons)
㈣ 怎么分析一个基因的稀有密码子
恩，，说一下原理。首先就是你要有表达载体的遗传密码表（大肠杆菌、赤毕酵母之类的），接着你要得到你序列的密码子使用频率，最后把这两个表进行一个对比，就可以得到基因中的稀有密码子。
具体的内部操作：找到一个使用最多的密码子，把这个密码子的分值定为1，然后以这个为标准，其他的密码子进行打分（因为使用频率最多的分值为1，所以其它的分值都是小于1的，比如0.8，0.7之类的）。最后对比分值，得分低的就是稀有密码子。当然这个不用自己做，现在有现成的在线稀有密码子分析工具，你直接把序列输进去就可以得到答案了。
㈤ 怎么分析一个基因的稀有密码子
NCBI没数据CodonUsageDatabase查相关物种密码偏信息
CodonUsageDatabase数据库用计算密码偏序列数据都自NCBI术界工业界经使用数据库该数据库用物种名索引使用前必须首先搞清楚所研究物种拉丁名（例 Homo sapiens）按字母浏览检索式该数据库象其物信息数据库灵其检索词要求比较严格能原些物种拉丁名非相似（例差数字）差错差毫厘 谬千反复核物种名应该使用该数据库重要步骤
要计算单或组基用其提供Countcodon服务()
㈥ 对蛋白无显着影响转录
影响蛋白表达的因素：
1. 载体构建错误
这个是很多克隆新人常犯的错误，在克隆时弄错读码框，从而导致蛋白不表达。蛋白表达载体构建正确是蛋白表达实验的基础，构建载体时要考虑启动子、多克隆位点、终止子、融合标签、复制子等多种因素。
2. 宿主菌选择不当
不同宿主菌的基因型不同，选择合适的宿主菌对某些特殊的载体进行蛋白表达至关重要。有时表达重组的毒素蛋白，对宿主细胞也有毒性，会造成质粒丢失。
3. GC含量
不同物种间基因组的GC含量有显着差异，GC含量通常间接对基因表达进行调控和影响，超过70%可能会减低蛋白表达水平。
4. 密码子优化
（1）密码子偏爱性
不同物种的基因在密码子使用上存在着明显的偏爱性，甚至同物种内不同功能的基因其密码子使用频率也存在较大的差异，密码子偏爱性对重组蛋白的表达具有深刻复杂的影响。
密码子的偏爱性是通过控制可用tRNA丰度影响蛋白的翻译过程，tRNA的缺乏可能导致对应的稀有密码子在蛋白表达过程中使翻译速率降低甚至终止，从而使蛋白水平显着降低。
（2）密码子的使用频率低。
某些基因本身含稀有密码子，拥有所用宿主的稀有密码子越多的基因，越难在该宿主中表达出理想水平的重组蛋白。可选用高频使用的密码子替代基因中存在的已选宿主的稀有密码子，或在排除原始基因中的稀有密码子的基础上进行重新合成，同时使密码子组成频率更接近宿主。
但是研究表明，密码子的优化必须与蛋白的高级结构联系起来，如果通过一味地替换稀有密码子来提高重组蛋白的表达可能会起到适得其反的结果。
5. mRNA二级结构
mRNA如果形成大而稳定的二级结构如发卡结构和茎环结构，尤其是起始密码子附近的稳定二级结构，将会影响mRNA在翻译过程中核糖体的结合和延伸，从而降低翻译的效率和最终的蛋白表达水平。如果序列里有和核糖体结合位点/或翻译起始位点互补的序列，由此形成的mRNA二级结构，会让翻译嘎然而止，此时就需要进行同义密码子替换。
因此，合理优化翻译起始区的mRNA二级结构，将有效提高目的蛋白表达水平。
6. mRNA的稳定性
蛋白的表达调控分为转录水平和翻译水平，一般来说，转录水平起关键作用，但同时翻译的效率与mRNA的降解直接相关，因此，也间接影响着转录后水平的调控。原核表达中，存在稀有密码子的mRNA翻译过程受到影响，使得mRNA得不到更多核糖体结合后的有效保护，也将导致mRNA的降解从而使蛋白积累水平显着降低。
7. 基因突变
碱基的缺失、插入或突变，都会对翻译的蛋白产生影响，在PCR扩增时，碱基序列突变为终止密码子，会导致蛋白翻译意外终止。所以在进行表达之前，通常要进行测序来避免这种情况的发生。
当然，影响蛋白表达的其他要素或优化方法还包括检查单核苷酸重复和密码子重复，起始密码子环境，终止密码子及其环境，避免内含子、隐蔽剪接位点、AT 富含区、内部核糖体进入位点 (IRES)、重组位点等不利元件，选择合适的 UTR 序列和信号肽序列，合理设计酶切位点、接头、融合基因、检测和纯化标签等，使基因进一步优化，检查无误后进行基因合成，以备后续的遗传转化和表达。
发布于 2020-10-20 11:22
女性的直觉可信度有多高？
烟雨平生
11 月，我出差的一个晚上，老公发了张洗澡后的照片给我。照片里，他裸着上半身，镜头对着盥洗台上的镜子。他在向我卖弄身材，我却敏锐的发现，我的小黑瓶换了个位置，从置物架上到了置物架下。他一个大男人，用女生护肤品做什么？我怀疑家里有女人，但当时不可能赶回去，也不想打草惊蛇，而且，万一猜错了怎么办？12 月中旬，我再次出差，并故意提前回来，见他不在家，就给他打电话，他说和哥们儿在酒吧，我直接去了我们常去那家酒吧。他确实和哥们儿在一起，坐在靠窗的卡座里，哥们在起哄，他和他的“好妹妹”抱着在啃！站在进门处的酒架玄关后，听着他们高声地起着哄，我气得浑身发抖，所有细胞都叫嚣着：冲过去，冲过去！撕烂这群混账！1我老公叫张迪，是我初恋。我不是那种很美的女生，在张迪之前，没有人追过我。当年张迪追我，我表面矜持，内心却怀着小庆幸和感激，只假装犹豫了一个晚上就答应了。他也不是帅气的男生。我以为丑一点安全，不会在外面招摇。我们很快在一起。我巴心巴肝对他好，我知道他有个白月光，是他的初恋，我看过照片，确实长得比我好。就是他正在啃的那个！一年多来，白月光和她第 N 任男朋友分了，找张迪哭诉。张迪这个万年备胎，天天请吃请喝安慰她，我虽心里不舒服，但张迪赌咒发誓，叫我相信他人品，说白月光现在只是他“妹妹”。白月光更是一口一个“嫂子”，一会儿倾慕我的才华，一会儿夸我是业界精英，一会儿说我御夫有术，说张迪对我多好多好……彩虹屁一个接一个，夸得我信以为真。加上白月光确实漂亮，和张迪站在一起，活脱脱一朵鲜花插在牛粪上，渐渐地，我对他们失去防范。上个月领证时，白月光还专门请我们吃饭，祝我们白头到老，说最幸运的事情就是通过张迪认识了我这个嫂子！如今……这算什么？！我冷静下来后，掏出手机，“啪啪啪”把他们抱着啃的场景拍下来。万事都要讲证据，就算离婚，就算闹上法庭，谁主张谁举证，我得呈上个东西。从这家酒吧出来，我到隔壁酒吧，找了个能看见这边门口的位置，点了杯威士忌加冰。一个多小时后，那对狗男女搂搂抱抱上了同一辆出租车，我尾随而至，竟看见他们回到我和张迪的住处！这是我们专门为结婚买的房子，刚搬进来不到半年。这简直是赤裸裸的侮辱！我坐在出租车上，指甲深深掐入肉里，眼睛瞪得生疼，脑海里全是冲上去手撕贱人，又或者捉奸在床的场景……然而，理智告诉我：这个时候手撕，结果不外乎简简单单离婚，对他们没有半点损伤，甚至有可能，这两人联合起来把我揍一顿！这年头，社会新闻版，原配捉奸，老公连同小三把原配揍一顿的事儿还少了吗？“小姐，你下车吗？”“不了。”我报了附近一家酒店的名字，我需要好好想想下一步怎么做，他们的软肋是什么。2几分钟后，张迪的电话打过来。我看着来电显示上“老公”二字，想起回来时放在客厅里的行李箱，迅速揉了揉脸，深吸了口气，这才接起电话——“老婆，你在哪儿呢？是不是回来了？我刚从酒吧回来，喝高了。”他的声音满是疲惫，装得很像。“我回报社了，专题出了点问题，所有人都在加班，不知道要忙到几点！”我忍着恶心，语气暴躁，“哎，先不给你说了，烦死了！这工作还有完没完！”“那你快忙，我等你。”张迪挂了电话。我冷笑。等我？怎么等？和白月光滚床单等吗？这种事情，从前发生了多少次？刚才他们进门时，看见行李箱吓一跳吧？！我买的房子，凭什么睡酒店的是我？！我今天的所有委屈，都要他们加倍奉还！那天夜里，我彻底失眠，一直在盘算……3第二天一早，我正在洗漱。张迪给我打电话，肉麻问我工作做完了吗？说心疼我，爱我，叫我忙完后赶紧回家休息。我对着镜子翻白眼，嘴痒痒想问他“床单洗了吗？房间通风了吗？骚味儿还有吗”，忍下后回答，“刚忙完，和同事吃个早饭就回。”上午 10：00，我回到小区。【第一件事不是回家，而是到小区物管处。】我谎称家中失窃，要求调取我们那层楼的监控。物管小妹妹认识我，带我到监控室，还专门给我匀了台电脑。我头天晚上已经把最近半年的出差时间列出来，坐在电脑前一个个时间段的找。那两个人，果然不要脸，每次还没进门，就已经抱着啃了起来。我们小区的监控视频保存时间是三个月，我在三个月的时间段里，找了四段他们抱着啃进门的视频。麻痹，要搞到外面去搞！我趁着没人注意，迅速用小 U 盘把那几段拷贝下来。【第二件事才是回家。】战场打扫得很干净，能打开的窗户都打开了，被褥叠得整整齐齐，垃圾桶里半点垃圾都没有。我的行李箱已经收拾好了，脏衣服丢在洗衣机，干净衣服挂在衣柜里。若不是亲眼目睹了昨夜的一切，我怕还会继续以为找到了真爱且体贴我的男人。我坐在沙发上，随手拿起放在沙发扶手上的 iPad，【打开微信】。这个男人，因为喜欢“吃鸡”（打游戏《和平精英》），微信常年登录状态。我先看了他和白月光的【聊天记录】。删得并不干净，却很聪明，言语中没有任何暧昧，也就是正常约饭的时间地点，且全是我会参加的。我冷哼，打开【“我”-“支付”-“钱包”-“账单”】，所谓百密一疏，上面每一笔从微信出去的开销都清清楚楚。发红包是日常，大大小小都有。然后是酒店的，看时间和价格应该是钟点房；情趣用品店的，不知道买的是什么；还有商场，花店，甜品店的众多开支……这两个人，挺频繁的。我没截图，而是用手机拍照，免得在 iPad 上留下痕迹。最后才是【打开炒股软件】。我是财经记者，和圈内很多大佬熟，这几年跟着他们赚了不少钱，特别是股市。张迪炒股是我手把手教的。他的账户密码都是我给申请的，他没改密码，方便我偶尔帮他操作，我拉了流水账出来，手机录了段视频。我和他虽然没办婚礼，但在法律上，那是实打实的夫妻。我不图他的钱，但我也不想我的钱被他算计了！婚前财产好说，婚后这半年还真不好说。有了这两份流水就不一样了，我们各自理财，他收入的绝大部分在股市，另一部分，微信支付账单显示得清清楚楚，花在白月光身上呢！说来可笑，我和他在一起两年，共同生活的开销基本花我的钱。我不是那种有了男朋友，就得让男朋友养我的人，我家的家庭教育是：【女人经济要独立，婚姻才有底气。】而现实生活，很多时候是：【男人把钱花在谁的身上，就会爱谁多一点，男人心疼钱，就会心疼女人。】4下午 3 点，张迪给我打电话。一是问我休息好了没，二是约我晚上在外面吃饭，说我“出差+加班”辛苦了，要好好犒劳。“还有谁？”我装作很随意地问。“昨天才和兄弟们喝了酒，今天不叫他们了。”张迪想了想，“周月说好久没见你了，要不我问问她？”周月就是白月光。“行，刚好带了伴手礼要给她。”我笑着说，“你不许提前说，不然惊喜就没了！”张迪一口答应，问我怎么没有给他买礼物？我心下鄙视，唇边笑意不减：“当然有了，晚上给你！是你喜欢的。”张迪在话筒那边亲了两下。这样亲昵的小举动，我以前受用极了，现在只觉恶心。张迪叫我再休息一会儿，晚上见。我哪敢休息？内心熊熊火焰让体内每个细胞都在燃烧。我“咻”的站起，先给“跑公安口”的闺蜜打了个电话，三言两语把事情说了，我需要监听器，问她除了某宝，还有哪里能买，立即马上就要。她说电子城，并给了我一个店铺的名字。我道了声谢。闺蜜“哎”了一声叫住我：“胜男，我可提醒你，监听这事儿是违法的，用这种方式取得的证据，法院不受理。”“我知道，一旦被抓，情节轻的，《治安管理法》，5 日以下拘留或 500 元以下罚款，重的就《刑法》了。”我说，“放心，不会扩散，更不会蠢到做证据，我会很小心不会被发现，我就想看看张迪到底是人是鬼！”闺蜜再次提醒我小心：罚款事小，留下案底事大。我“嗯”了一声，飞快洗澡、换衣服、化妆……5吃火锅的地方是我们经常去的那家。我给白月光送了一支 A 牌的口红，又配了一支手工唇膏，监听器贴在手工唇膏的内管底部。我给她说，手工唇膏是我亲手做的，出差的时候，有半天闲暇，就在店里学做了几支。白月光抱着我的手臂，蹭了又蹭，一个劲儿的夸我能干，不但会炒股，还心灵手巧，连唇膏都会做。至于 A 牌的口红，她明显更喜欢，眼睛里闪着光，说刚好没有那个色号，夸我敞亮大气。张迪在旁边看着，假装吃醋地说，我对白月光比对他还好。“那是自然，我比你好看！”白月光撒娇地瞥了他一眼，“胜男姐若是男生，我肯定主动追求她！”张迪笑着点餐，在菜单上勾勾画画。我瞟了几眼。怎么说呢？很多细节，当一个人信任另一个人的时候，是不会发现的；可当信任崩塌，每一个细节都是疑点。张迪勾菜品时，最先勾的是白月光喜欢的，然后是他喜欢的，最后才是我爱吃的。我暗骂自己从前蠢，白月光这种存在，根本不该掉以轻心。火锅吃了一半，张迪和白月光有一搭没一搭问我，这次出差有什么收获？临近过年，有没有什么好股推荐？这是日常话题，每次和他们一群人吃饭，聊得最多的就是股票，基本是我叫他们买什么，他们就买什么，也基本都能赚。这一次，我没立即回答。我说要好好研究一下，买个普通的，和大盘持平没意思，得找个大牛，狠狠赚一笔。那两个人眉开眼笑。我也在笑。我不是善男信女，别指望我被绿了后，还帮你们赚钱！6送给张迪的是一个 L 家的钱夹子，比他之前的钱夹子高出了不止两个档次。“我以为你就记得周月，看你对她比对我还好。”张迪坐在我旁边，美滋滋地把各种卡片从老的钱夹子换到新的钱夹子里。“哪能呢？”我削着橙子，心想我 TM 以前真是犯贱，嘴上笑着，“还不是看在你的面子上，说白了，也是想给你争口气。我就是想告诉她，没了她，你一样过得好，而且能过得更好！”张迪坐的位置在我后方一点，我能很清晰感觉到他看着我。若是以前，我肯定会以为他又被我感动了，如今，我只觉可笑。他心里想的是“傻瓜”吧！这世上哪有那么多“感动”与“被感动”，大多数时候我们以为的“感动”都只是“自我感动”。“胜男，你对我真好！”他从后面抱住我。我心里烦腻，感觉恶心，脏。我不是有洁癖的人，耍朋友之前，他有多少女人都与我无关，可现在，我们是夫妻，他再在外面乱搞，我就觉得脏。我把削好的橙子分一半给他，催促他吃了就去洗澡。他可能误会了，三两口把橙子吃完，表示“立即马上洗香香，为老婆服务”，我笑笑，慢条斯理把另外一半橙子吃完，然后把事先准备好的监听器塞到钱夹子里。现在的钱夹子，除了身份证经常用，社保卡偶尔用，其他各种卡，银行卡也好，贵宾卡也罢，一年用不了两次，基本就是个摆设。我不担心他会发现，就算发现，不认就是了，再说，我只打算偷听几天，等监听器没电了，随便找个机会把监听器丢了。7监听器的软件没在我日常用的手机上。我头天买监听器的时候，顺便买了个二手手机，找同城快递送到报社，收件人是我。那时的我，做梦也没想到——安上监听器那一刻，就等于推下了多米诺骨牌的第一块，之后，每一个骨牌倒下，都仿佛开启一个潘多拉盒子。人性的恶，像深渊里的龙。 第 2 章 人生是多米诺骨牌快递放在报社门卫处，我取出手机，迫不及待来到小办公室，戴上耳机。出乎意料的是，白月光居然还有个男朋友，而且就那么巧，昨天晚上，她去了男朋友那里，并把我送给她的唇膏送给男朋友。之后是一大段“嗯嗯啊啊”，停顿处有聊天。白月光问男朋友“什么时候带她回家”，抱怨“从来没见过男朋友的朋友”。男朋友坦然说“家里不会同意”，说白月光配不上他，还说像他那种家境，肯定要找个门当户对的。我很不厚道地笑了。被张迪捧在手心的女神，在富二代眼里，也就是个见不得光的。监听器有定位，我瞟了眼手机上的位置，对方在我市很出名一个高档小区，住的人非富即贵。白月光哭唧唧：“你把我当什么了？pao 友吗？我一心一意对你，没想到你是这样的人！我要分手！”富二代赶紧哄着：“现在是创业期，外人看起来风光，其实一年营收不过几百万，和家族企业比起来，不过九牛一毛。”还说等事业做起来了，白月光是唯一同甘共苦的女人，要【送她一辆玛莎拉蒂做聘礼】！玛莎拉蒂！我承认，我酸了，世人皆爱绿茶。“你那公司，什么时候起来啊？”白月光撒娇地问。“快了快了，等风口。风口一到，猪都能飞到天上去！”富二代亲呢地说，然后一大堆对未来的畅想。核心一个词：区块链。很不巧，因为比特币的缘故，我了解过区块链，也采访过国内区块链公司，多少懂一点。富二代那一套说辞，既没含金量，也没差异化优势，甚至还有金融概念模糊不清的地方。我怀疑白月光被骗了。这年头的富二代，家里普遍重视教育，无论学识还是见识，都比普通人高许多，在不擅长领域创业的可能性实在太小。8唇膏留在富二代那里，监听器同样留在那里。我把线路切到张迪那边，他一上车就拨通了白月光的电话。车载蓝牙。我把两人对话听得清清楚楚——“丑死了，每天早上醒来吓一跳，以为旁边睡了个鬼！月儿，你老公每天就靠着你洗洗眼睛才能活下来……想到还要和母夜叉生活几年，我就头发发麻，万一熬不住怎么办？”“那咱们中午老地方见？”白月光吃吃笑，“……想想丑八怪的钱，还有好几套房子，乖，你再忍忍……我待会儿好好犒劳犒劳你！”张迪“嗯”了一声，语气轻佻，“你知道我喜欢什么。”白月光声音娇得都快滴出水了：“知道……讨厌得很……”两人一直撩骚。我心脏位置的那团火，如火山一般，疯狂的喷涌着！眼睛也痛得不得了。这就是我要嫁的男人……一口一个母夜叉，还自称是其他人的老公！我的自尊在这一刻被人狠狠踏入泥里，反复摩擦！9我给跑公安口的闺蜜打电话，几分钟后，她敲我办公室的门。开门后，她吓了一跳：“你眼睛怎么红成这样？……张迪又怎么了？”我把耳机递给她，调出车上那段话。她同样气得够呛，一个劲儿地骂“混蛋，垃圾，人渣”，问我打算怎么办？怎么办？这可不是简单的【婚内出 gui】，【嫌我丑了】，张迪明确地表示“只生活几年”，白月光更是直接提醒他，为了钱和房子！也就是说：这场婚姻，原就是一场算计！我的房子！我的存款！我炒股的眼光！甚至，我爸妈的财产！爸妈只有我一个女儿，我们在老家有三套房子，其中两套都写着我的名字，他们说的几套房子，应该就包括这两套！我盯着比我大几岁的闺蜜，半晌咬着牙：“姐，帮我！”10我的眼睛气得充血了，眼白几乎看不见，真正恐怖。我跑去医院开了许多药，然后顺理成章成了病人，不履行妻子义务，每天背对他睡觉。张迪省得看见我的脸，但他又是个欲望很强的人，晚上得不到排解，每天都要找白月光。白月光很忙，一个人应付两个男人。陪睡不是事儿，真正麻烦的是，她要努力让自己配得上“富二代”。【她缺钱，缺很多很多钱。】她不止一次问张迪也问我，什么时候才能选出牛股，最好天天涨停。她想在年前套现一大笔，注资“富二代”的公司，然后趁着过年，作为合作伙伴，也作为女朋友，和富二代回家见家长。当然，这些话不可能给张迪说。她给张迪的版本是：一想到张迪和我结婚就心痛……她想狠赚一笔，不为了钱委屈自己……想张迪早点离婚，他们好早点名正言顺在一起。张迪很感动，当天下午没上班，和白月光在酒店厮混，还给我打电话，说晚上加班很晚才回。我呵呵哒。几个人中，最忙的是“富二代”。那是个实打实的“海王”，除了周月，还有 ABCD 好几个女朋友。他比张迪聪明。人设高高在上，“富二代”，“家族企业”，“创业精英”，住豪宅开豪车，擅说甜言蜜语，且出手大方，就我在监听器里听到的，每每送出去的，不是顶级护肤品就是奢侈品牌的包。他的众女友最近有一个共同目标：过年回家见家长。只可惜，时机不利！富二代一会儿要扩大公司规模，一会儿公司偷税漏税被查，一会儿打算投资地皮……总之，资金周转不灵，这时候若带女友回家，必定遭人诟病。女朋友们有的提出向公司注资，成为股东，有的直接借钱给富二代。富二代承诺所有打算给他拿钱的女人，过年带她们回家，排除万难也要在一起！我和闺蜜对视着，异口同声说了三个字：“杀猪盘！”11“杀猪盘”是诈骗团伙自己起的名字。姑娘们是“猪”，人设和恋爱是“猪饲料”，恋爱过程是“养猪”过程，最后骗取钱财，就是“杀猪”。富二代打算批量杀猪。我和闺蜜第一反应是【报警】，多年记者生涯，特别她跑公安口的，正义感比普通人更重。第二反应才是，我们可以【利用“富二代”狠狠报复白月光和张迪】。选 A 还是 B，我和闺蜜陷入两难。正如之前《奇葩说》的一期节目：“美术馆着火了，一幅名画和一只猫，只能救一个，你救谁？”名画是遥远的哭声，那些我们没有看见的，推测出来的受害人是遥远的哭声。猫是近处的哀嚎，我被欺骗的爱情，被摁在地上反复摩擦的自尊是近处的哀嚎。我们最终【选择了自私】，重新设计了报复的每一步，且把“杀猪盘”列为报复的重要环节。我发誓，这辈子，我从来没有干过如此爽快的事！
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哇偶偶
你好，请问诱导温度和溶氧量对蛋白诱导表达过程的影响有哪些，就是小量诱导表达时温度偏高，到大量诱导表达时考虑到溶氧量不同而降低诱导温度，这一过程中温度和溶氧量有什么关系，为什么溶氧量低了要降低诱导温度
2022-09-15
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普健生物
作者
这个问题涉及到发酵。简单来说，一定条件下温度越低溶氧含量越高，温度越高溶氧会降低，当溶氧量降低则会在发酵过程中产生杂菌以及菌体代谢异常等
2022-09-15
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蛋白表达
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蛋白表达的影响因素
2 年前
普健生物
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普健生物有五大蛋白表达平台，分别为大肠杆菌表达系统、枯草芽孢杆菌表达系统、酵母表达系统、哺乳表达系统、昆虫-杆状病毒表达系统，可以提供从基因设计、基因优化、基因合成、亚克隆、蛋白表达测试、蛋白放大与纯化的一站式蛋白表达纯化服务。
凭借我们多年的蛋白表达服务经验，谈谈影响蛋白表达的因素有哪些。
影响蛋白表达的因素：
1. 载体构建错误
这个是很多克隆新人常犯的错误，在克隆时弄错读码框，从而导致蛋白不表达。蛋白表达载体构建正确是蛋白表达实验的基础，构建载体时要考虑启动子、多克隆位点、终止子、融合标签、复制子等多种因素。
2. 宿主菌选择不当
不同宿主菌的基因型不同，选择合适的宿主菌对某些特殊的载体进行蛋白表达至关重要。有时表达重组的毒素蛋白，对宿主细胞也有毒性，会造成质粒丢失。
3. GC含量
不同物种间基因组的GC含量有显着差异，GC含量通常间接对基因表达进行调控和影响，超过70%可能会减低蛋白表达水平。
4. 密码子优化
（1）密码子偏爱性
不同物种的基因在密码子使用上存在着明显的偏爱性，甚至同物种内不同功能的基因其密码子使用频率也存在较大的差异，密码子偏爱性对重组蛋白的表达具有深刻复杂的影响。
密码子的偏爱性是通过控制可用tRNA丰度影响蛋白的翻译过程，tRNA的缺乏可能导致对应的稀有密码子在蛋白表达过程中使翻译速率降低甚至终止，从而使蛋白水平显着降低。
（2）密码子的使用频率低。
某些基因本身含稀有密码子，拥有所用宿主的稀有密码子越多的基因，越难在该宿主中表达出理想水平的重组蛋白。可选用高频使用的密码子替代基因中存在的已选宿主的稀有密码子，或在排除原始基因中的稀有密码子的基础上进行重新合成，同时使密码子组成频率更接近宿主。
但是研究表明，密码子的优化必须与蛋白的高级结构联系起来，如果通过一味地替换稀有密码子来提高重组蛋白的表达可能会起到适得其反的结果。
5. mRNA二级结构
mRNA如果形成大而稳定的二级结构如发卡结构和茎环结构，尤其是起始密码子附近的稳定二级结构，将会影响mRNA在翻译过程中核糖体的结合和延伸，从而降低翻译的效率和最终的蛋白表达水平。如果序列里有和核糖体结合位点/或翻译起始位点互补的序列，由此形成的mRNA二级结构，会让翻译嘎然而止，此时就需要进行同义密码子替换。
因此，合理优化翻译起始区的mRNA二级结构，将有效提高目的蛋白表达水平。
6. mRNA的稳定性
蛋白的表达调控分为转录水平和翻译水平，一般来说，转录水平起关键作用，但同时翻译的效率与mRNA的降解直接相关，因此，也间接影响着转录后水平的调控。原核表达中，存在稀有密码子的mRNA翻译过程受到影响，使得mRNA得不到更多核糖体结合后的有效保护，也将导致mRNA的降解从而使蛋白积累水平显着降低。
7. 基因突变
碱基的缺失、插入或突变，都会对翻译的蛋白产生影响，在PCR扩增时，碱基序列突变为终止密码子，会导致蛋白翻译意外终止。所以在进行表达之前，通常要进行测序来避免这种情况的发生。
当然，影响蛋白表达的其他要素或优化方法还包括检查单核苷酸重复和密码子重复，起始密码子环境，终止密码子及其环境，避免内含子、隐蔽剪接位点、AT 富含区、内部核糖体进入位点 (IRES)、重组位点等不利元件，选择合适的 UTR 序列和信号肽序列，合理设计酶切位点、接头、融合基因、检测和纯化标签等，使基因进一步优化，检查无误后进行基因合成，以备后续的遗传转化和表达。
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㈦ 稀有密码子在基因工程中有何影响
（1）E·coli DNA连接酶源于肠杆菌用于连接粘性末端； （2）T4DNA连接酶：源于T4噬菌体用于连接粘性末端平末端连接效率低 （3）热稳定DNA连接酶（thermostableDNAligase）嗜热高温放线菌（Thermoactinomycest
㈧ 密码子优化
利用不同的细胞表达，对密码子的偏好性是不同的，只要注意选择他们最喜欢的密码子同时避免稀有密码子即可，密码子优化原则就是这样很简单，但是进行优化要了解大量的知识，不然怎么判断不同的细胞到底喜欢哪些密码子呢，但是又说回来，例如大肠杆菌或灵长类动物，他们对密码子的偏爱性又是固定的。。。。要注意的点就是密码子优化之后，要保证表达的产物蛋白是没有变的，因为密码子的简并性，可以很方便的优化
如有帮助，请采纳~谢谢
㈨ 急用！一论述题:如何克隆一个功能性基因，如何在原核系统中高效表达
你的题目关键是解决两个问题：一是功能性基因在原核生物中的表达；二是如何高效进行表达。
帮你在网上找到一入篇相关的文章。节选相关性较大的内容如下，有需要的话，你追问我给你链接，因为网络会吞掉带有链接的回复。
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1、原核生物只有一种RNA 聚合酶（真核细胞有三种）识别原核细胞的启动子，催化所有 RNA的合成。
2、原核生物的表达是以操纵子为单位的。操纵子是数个相关的结构基因及其调控区的结合，是一个基因表达的协同单位。调控区主要分为三个部分：操纵基因、启动子及其他有调控功能的部位。
3、功能性基因一般是真核生物所具有的基因，而真核生物基因基本具有外显子和内含子等结构。原核基因一般不含有内含子，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统，因此当克隆的含有内含子的真核基因在原核细胞中转录成 mRNA 前体后，其中内含子部分不能被切除。
4、原核生物基因的控制主要在转录水平。这种控制要比对基因产物的直接控制要慢，对RNA 合成的控制有两种方式：一是起始控制(启动子控制)，二是终止控制(衰减子控制)。
5、在大肠杆菌（大多工程菌都是使用大肠杆菌）mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及同16S核糖体RNA 3'末端碱基互补的序列，即 SD 序列，而真核基因则缺乏此序列。因此，真核基因本身的mRNA前端部分不能直接使用，需要进行一定的修饰。
将外源基因在原核细胞中表达，必须考虑表达载体、外源基因的性质、原核细胞的启动子和 SD 序列、阅读框架及宿主菌调控系统等基本条件，也就是说必须满足以下条件：
⑴通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白；
⑵外源基因不能带有内含子，因而必须用 cDNA 或全化学合成基因，而不能用基因组 DNA；
⑶必须利用原核细胞的强启动子和 SD序列等调控元件控制外源基因的表达；
⑷外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架(open reading frame)；
⑸利用宿主细胞的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达对宿主菌的毒害。
大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛的表达系统，由于待表达的外源基因结构具有多样性，尤其是真核生物基因的结构与大肠杆菌基因结构之间存在较大的差异，因而在构建表达系统时必须具体情况具体分析。一般来说，高效表达外源基因必须考虑以下基本原则：
①优化表达载体的设计。为了提高外源基因的表达效率，在构建表达载体时对决定转录起始的启动子和决定 mRNA 翻译的SD序列进行优化。具体方法包括组合强启动子和强终止子；增加 SD 序列中与核糖体 16S rRNA 互补配对的碱基因序列，使 SD 序列中6～8 个碱基与核糖体16S rRNA 的碱基完全配对；根据待表达外源基因的不同情况调整 SD 序列与起始密码子 ATG 之间的距离及碱基的种类；防止核糖体结合位点附近序列转录后形成“茎环”二级结构。
②提高稀有密码子 tRNA 的表达作用。多数密码子具有简并性，而不同基因使用密码子的频率不相同。大肠杆菌基因对某些密码子的使用表现了较大的偏爱性，在几个同义密码中往往只有一个或两个被频繁地使用。同义密码子使用的频率与细胞内相应的 tRNA 的丰度呈正相关，稀有密码子的tRNA在细胞内的丰度很低。在 mRNA的翻译过程中，往往会由于外源基因中含有过多的稀有密码子而使细胞内稀有密码子的 tRNA供不应求，最终使翻译过程终止或发生移码突变。此时可通过点突变等方法将外源基因中的稀有密码子转换为在受体细胞中高频出现的同义密码子。
③提高外源基因 mRNA 的稳定性。大肠杆菌的核酸酶系统能专一性地识别外源 DNA或 RNA并对其进行降解。对于 mRNA 来说，为了保持其在宿主细胞内的稳定性，可采取两种措施，一是尽可能减少核酸外切酶可能对外源基因 mRNA的降解，二是改变外源基因 mRNA 的结构，使之不易被降解。
④提高外源基因表达产物的稳定性。大肠杆菌中含有多种蛋白水解酶，在外源基因表达产物的诱导下，蛋白水解酶的活性可能会增加。因此，须采用多种措施提高外源蛋白在大肠杆菌细胞内的稳定性。常用的方法包括：将外源基因的表达产物转运到细胞周质或培养基中；选用某些蛋白水解酶缺陷株作为受体菌；对外源蛋白中水解酶敏感的序列进行修饰或改造；在表达外源蛋白的同时，表达外源蛋白的稳定因子。
⑤优化发酵过程。在发酵罐内工程菌生长到一定的阶段后，开始诱导外源基因的表达，诱导的方式包括添加特异性诱导物和改变培养温度等。使外源基因在特异的时空进行表达不仅有利于细胞的生长代谢，而且能提高表达产物的产率。生物因素的第三方面是提高外源基因表达产物的总量。外源基因表达产物的总量取决于外源基因表达水平和菌体浓度。在保持单个细胞基因表达水平不变的前提下，提高菌体密度可望提高外源蛋白质合成的总量。