‘壹’ 放置离体没用的标本放冰箱要几度
-80度保存，组织要切小块，浸泡~提RNA，无论长短，可以存放10年都没问题.
标本采集是我们实验一个重要的前期工作，但是大多数研究人员对标本采集以及保藏的步骤及相关注意事项知之甚少。签署术中标本留取活检协议书，同时与临床科室、手术室密切联系，并由临床医生填写标本入库登记表，事先跟病理科医生协商，在组织标本足够大，能确保病理检查的前提下，切取少许组织进库保存，遇到小组织标本要果断放弃收集。在标本离体后应在最短时间内(<30
min) 更换器具切取包括肿瘤、瘤旁、正常组织组织标本，成直径约0.2 cm～0.5
cm的组织块，各取2块～4块，分别装入已编号的带有橡皮垫圈的灭菌冻存管中，旋紧盖子后放入液氮转移罐，防止冷冻后爆管。
‘贰’ 核酸样本要求在多少度保存运输
一般冰箱内温度为0℃-12℃，冷冻室温度为5℃-18℃。标本携带者和接受者应对病毒分离和核酸检测标本进行双签。24小时内可检测的标本可保存在4℃下。24小时内无法检测的标本应保存在-70℃或以下(如无-70℃保存条件，则临时保存在-20℃冰箱中)，并设置专门的库房或柜台单独存放标本，避免标本在运输过程中反复冻融。
标本采集4小时后，应在室温下保存不超过4小时，2-4小时内送至实验室。应设立专门的库或专柜，单独保存样品。一般核酸检测的样本需要低温保存，短时间内就会送检，最多不超过4小时。所以室温下放18个小时应该是没用的。
标本采集后室温保存不超过4小时，并在2~4小时内送至实验室，避免标本运输过程中反复冻融。
如需长途运输标本，应采用干冰等冷藏方式保存，并严格按照相关规定对包装和运输标本的接受者进行个人防护，按照采样人员的防护装备执行。
标本接收人员的个人防护应根据采样器的防护装备进行。核酸试剂应保存在核酸试剂低温冰箱中，特别是24小时内不能用完的试剂必须保存在-20℃以下的低温冰箱中。
‘叁’ 10X 单细胞基因表达样本制备指南
单细胞转录组学是阐明复杂生物系统的一种强大工具，让您能够逐个细胞地研究基因表达动态。通过生成细胞群体的单细胞图谱，单细胞RNA测序(scRNAseq)能够解析复杂样本中不同类型细胞之间的特定差异。单细胞基因表达谱分析带来了疾病发展过程中有关细胞进程的重要见解 。scRNA-seq 技术的进步让研究人员能够获取之前经常会被大量（Bulk）细胞的RNA-seq方法所掩盖的关键数据，如罕见或新的细胞类型，从而在单细胞水平上探索真正的基因表达多样性(图1)。
然而，为了充分利用这种革命性的技术，必须妥善地制备单细胞样本。本文对制备单细胞样本的建议进行了概括，这些样本可用于10x Genomics的单细胞基因表达（Single Cell Gene Expression）或免疫分析（Immune Profiling）解决方案。
scRNA-seq样本制备方案
• 细胞解离操作的技巧
• 移液技术和枪头选择
• 细胞清洗与过滤
• 细胞计数和活力评估
• 样本制备后的保存
首先，建议采用无菌的样品处理，包括使用不含核酸酶的试剂和耗材。为减少对细胞的损伤，移液和离心应保持在最低程度。在给定的离心速度，时间和温度下，细胞浓度和大小直接影响制备的效率。紧密堆积的细胞沉淀可能需要额外的操作，但也因此可能会通过剪切效应损害细胞。当然，在这个时候，离心条件需要调整。
此外，在进行细胞清洗和重悬过程中，使用足够的容积也是避免高浓度导致细胞集聚和结块的途径。悬液需要通过合适的细胞过滤器进行筛选来去除结块和碎片。这里推荐的细胞清洗和重悬液为包含牛血清白蛋白的磷酸盐（不含有钙镁离子）。原代细胞，干细胞和其他一些敏感细胞在清洗和重悬过程中需要更换缓冲液以确保活性。细胞团导致自动细胞计数器低估了单细胞的有效浓度。因此，悬浮液应在制备后尽快处理，最好在30分钟内。
在单细胞准备过程中应尽量减少细胞集聚，死细胞，无细胞的核酸和反转录抑制剂的存在。为了最大限度地减少这些污染，同时最大化不同细胞类型的纯度和无偏差恢复，可能需要条件优化（例如，调整洗涤步骤的数量，洗涤溶液的组成，离心条件和过滤器类型）。
为了获得活力高的细胞并 尽量避免细胞死亡和裂解 ，您需要根据特定的样本类型来优化细胞解离的操作。死细胞会裂解，并向周围环境释放RNA；这种游离RNA会造成检测的背景噪音，并影响单细胞数据的质量。若细胞得到妥善处理，将会对测定产生直接影响，这些测定决定了上样到系统的细胞数量以及回收的细胞数量。遵循下面的指南可提高细胞计数的准确性，并最大限度减少样本之间的差异。
充分了解对于 样本类型 的限制和要求将有助于产生更加可靠的数据。许多现有的样本制备方案可以解决这些问题，不过或许需要根据您特定的样本类型进行调整。例如，悬浮细胞系、磁珠富集的细胞和流式分选的细胞已经处于悬浮状态，只需要进行清洗和计数，即可用于Chromium单细胞基因表达或免疫分析解决方案。然而，在处理组织时，必须在第一次文库制备之前很好地优化解离方案，以确保达到最佳质量。我们提供了多个示范方案，指导您优化样本制备.
另一个考虑因素是 不同类型细胞 中的起始RNA含量各异，而RNA起始量的准确测定将影响流程中的一些关键决策，如文库制备时的PCR循环数。例如，人外周血单核细胞（PBMC）中的RNA很少，每个细胞只含有0.75 pg，而HCC38细胞系则富含RNA，每个细胞可达21.6 pg（表1）。
在解离组织或处理悬浮状态的细胞时， 移液技术 是至关重要的。例如，当细胞静置在管中时，它们会开始沉降。从溶液的顶部或底部吸取时，吸到的细胞数量可能有很大差异，尤其是在细胞快速沉降时。因此，在吸取前一刻应当通过移液器 充分而轻柔地混合细胞悬液 ，然后每次从管的 中部吸取 ，通常低于溶液的中间标记。
此外，移液时必须 轻柔 地处理细胞。如处理手法比较剧烈，即便采用大口径的移液吸头，也会对样本质量造成负面影响。表2比较了在HEK293T细胞上开展的四个不同的细胞混合实验得到的单细胞数据的关键指标。剧烈的移液混合和涡旋振荡都会导致细胞过早裂解，从而在周围环境中产生高水平的RNA，引起系统中的背景噪音，并最终降低细胞reads数的比例（以蓝色高亮 显示 ） 。 同样地， 每个细胞的基因数中位值也会因剧烈地细胞处理而减少（表2）。因此，细胞悬液应该通过 大口径的移液吸头来轻柔混合 。这将有助于获得背景更干净的数据，增加文库的复杂性（即增加每个细胞的基因数中位值），并提高细胞reads数的比例。
在处理悬浮细胞系、解离组织或大量细胞时，我们强烈建议您采用 彻底的清洗方案 ，这将影响上样至Chromium Controller后的细胞回收。具体方案可根据样本类型以及scRNA-seq方法而调整。我们提供的scRNA-seq清洗方案需要用到含0.04% BSA的PBS溶液，用于细胞的清洗和重悬。
大的细胞团块或碎片会增加微流体芯片的堵塞风险，并且干扰准确的细胞计数，从而影响细胞回收，特别是在使用自动细胞计数器时。为了避免这一问题，我们建议您将细胞悬液上样到微流体芯片之前，使用孔径为30-40 μm的细胞过滤网。很多过滤网已成功通过测试，可用于我们单细胞基因表达和免疫分析解决方案中的样本。
值得注意的是，每次过滤都会导致细胞悬液体积的减少以及细胞浓度的变化。如果需要过滤，您 应当在过滤完成后对单细胞悬液进行重新计数。
为从悬液中获得单细胞，样本需要通过梯度离心。实体组织需要在一开始进行机械分离或者酶消化处理。首先，组织需要通过物理切割或者刀片切碎，然后通过酶消化来分离细胞。特定的组织消化酶及消化时间见下表。
酶种类包括Accutase, elastase，collagenases，商业化的酶试剂包括TrypLE Express，Liberase Blendzyme 3。细胞裂解后可能会引起细胞聚集，可通过用DNase I处理来降低集聚。最后，悬液通过过滤器进行过滤以达到纯化目的。
值得注意的是，样本准备过程可能会引起细胞中基因表达模式的改变，特别是一些胁迫相关基因的激活。此外，一些敏感的细胞亚型可能在此过程中受到伤害。所以， 样本准备过程越短越好 。相反，如果消化时间太短，可能细胞分离不完全，需要在后续单细胞分析过程中排除掉这些紧密相连的细胞。
为避免细胞组成背景，可以通过破坏细胞膜，分离细胞核来实现。对细胞核RNA进行测序，也是一种分类细胞类型的好方法，但可能会对每个细胞的整体理解会产生偏差。单细胞核RNA测序已经不同的神经细胞研究中有所运用，因为成人神经组织细胞是高度内联的，无法有效分离。
在评估样本质量时，您需要在细胞清洗和过滤之后测定细胞活力，这一点至关重要。测定细胞活力有许多种方法，但我们发现 台盼蓝排除法 在鉴定活细胞与死细胞的比例时效果很好。最终细胞计数的准确性以及目标回收量和实际回收量之间的一致性，取决于我们了解样本中有多少个细胞。一旦过滤和清洗完成，可采用细胞计数设备（如血球计数器或自动细胞计数仪）进行定量。这些设备不仅能提供准确的细胞计数，还能计算出向微流体芯片上样适量细胞所需的细胞悬液体积。
响最终细胞计数准确性的另一个重要因素是 细胞储存液的浓度 。我们发现，浓度介于700-1,200个细胞/μL的细胞储存液是最佳的，可以让回收细胞的数量达到目标值（图2）。细胞悬液的浓度一旦超出这个最佳范围，将会导致细胞计数不可靠。如果样品在这个范围以外，我们建议相应地调整细胞储存液的浓度。
高比例的死细胞可能会影响目标细胞的回收量，因此对于死细胞比例较高（>30%）的样本，我们建议您参考从单细胞悬液中去除死细胞的示范方案。此方案概括了一些最佳做法，能够降低单细胞悬液中的死细胞比例。
为了最大限度地减少转录组的变化，在对细胞进行清洗和计数后，单细胞悬液应当保存于冰上，直至用于后续的上机和文库制备步骤。在理想状况下，一旦制备好样本，应当在30分钟内将其用于下游步骤。
然而 ，您还有必要了解各类细胞的不同性质，因为这可能会影响细胞应在冰上保存的时间，以及它们在制备后多久便应当被尽快使用。例如，有些细胞（如PBMC）如果在冰上放置一段时间，它们就开始形成团块。这些团块很难解离，增加了堵塞的风险，而且每个团块被当成单细胞计数，又降低了细胞计数的准确性。此外，有些细胞更加粘稠，形成团块的速度更快。对于这些细胞，必须尽量减少制备和使用之间的时间差。
大部分的scRNA-seq都是用新鲜分离细胞进行实验。但是，由于研究和临床实验特殊性，缺少足够的所需基础设施或专用设备，而使得对样本进行快速处理显得非常困难。另外，有些样本需要在多个不同的时间点进行收集，同时为避免技术误差需要样本在同一时间进行单细胞实验过程。因此，有效的样本保存方案是实现样本采样位置和时间与下游实验过程分开的解决方法。
有研究表明，当样本保存在-80℃或者液氮一年，随后解冻，来自细胞系和原代样本的冷冻保存的细胞显示出与新鲜制备的细胞类似的RNA分子的完整性，基因表达谱也没有明显改变。当然，应尽量避免细胞多次冻融。同样，甲醇固定已被确立为基于液滴的单细胞方法的替代性方案，也可避免由于样本处理时间延长而引发的基因表达变异。重要的是，冻存和固定方法都可以实现样本的储存和运输，扩大scRNA-seq方法的应用范围，例如，扩展到临床领域。然而，这两种方法都显示出细胞类型组成的潜在偏差，强烈建议彻底评估未经测试的新细胞类型的保存方法前不易直接使用。对于先前已保存的样品，例如速冻样品，细胞核测序是唯一的scRNA-seq解决方案。这是因为与冷冻保存不同，快速冷冻过程中冰晶的形成破坏了外部细胞膜，但是细胞核保持完整。但是，这也应该优先对RNA完整性进行初始估计，以避免与样品质量相关的偏差。
Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies
来自《Nature Protocols》的单细胞转录组研究样本准备指南
https://assets.ctfassets.net/an68im79xiti/4cFfVJH95mgYeSIcEAUE6Y//CG00054__-_CultCells_RevB.pdf
https://assets.ctfassets.net/an68im79xiti/2Sd6Fyx0YMqCC4m2uocS2u//CG000126_Guidelines_for_Optimal_Sample_Prep_Flow_Chart_RevA.pdf
‘肆’ 标本盒菌株在异地运输时必须坚持什么
要坚持保温，快速，密闭，避光，安全。
普通菌种最适温度为4度，对于肺炎链球菌等特别难保存的需要负20度保存。标本在输运送过程中，应防止标本容器的破碎和标本的丢失，注意容器的密闭、避光（如阳光直射下血中胆红素会分解），同时应注意生物安全，防止意外发生。常见检验项目标本转送要求：
1、采样后须立即送检的常规项目 血氨、血沉、血气分析、酸性磷酸酶、乳酸以及各种细菌培养，特别是厌氧菌培养。
2、采样后0.5小时内送检的常规项目 血糖、电解质、血液细胞学、凝血试验、体液细胞学、涂片找细菌、真菌等。
3、采样后1~2小时内送检的常规项目 各种蛋白质类、色素类、激素类、脂类、酶类、抗原、抗体测定等。
4、采集后立即冰冻的检测项目 需要对标本冰冻的检测物质有促肾上腺皮质激素（ACTH）、乙酰胆碱酯酶（ACE）、丙酮、血氨、游离脂肪酸、乳酸、丙酮酸盐和肾素。
5、需避光的检测项目 感光物质需避光以保持稳定性，如胆红素、β-胡罗卜素和红细胞原卟啉等，可以用铝制盖子罩在试管外壁光。
标本采集后立即送检，若有延迟也应在2小时内送到实验室，否则会影响病原菌的检出，一般性的细菌培养标本若需延迟送检时，应置于4度冰箱保存，且不能超过24小时。临床标本最佳运送时间取决于标本的量，少量液体（小于1ml）或组织（小于1cm3）应在15~30分钟内送到实验室，较多量的标本置于运送培养基中可放12~24小时，厌氧培养标本原则上是床边接种，如延迟送检，需保存在厌氧运送培养基中，室温保存，不得超过24小时。
‘伍’ 用于提取RNA新鲜组织如何保存
市场上有一种非冰型RNA样品保存液.有些公司叫RNAwait,或者还有别的名称,你可以了解一下.
很多公司都有的.
非冻型组织细胞RNA保存液（RNAwait）是一种在较高温度下保存动物组织及细胞RNA样品的非冻型无毒溶液，它能迅速渗入细胞内，通过高效抑制RNase的活性而保存RNA的完整性。
产品特点
1．操作简单，将组织剪薄浸没在RNAWAIT中即可使其RNA不被降解。
2．替代液氮，使样品的保存不需液氮，干冰或-80℃冰箱，尤其适用于临床和野外样品的快速和大规模采集。
3．RNA完整，因RNAwait能迅速抑制组织中RNA酶的活性，故从中提取的RNA的质量跟液氮保存的样品相比不相上下。
4．方便运输，处理过的样品能在25℃保存一周，使样品邮寄和运输变得容易和便宜，有利学术合作和交流。
5．反复冻融，经RNAwait处理的样品可反复冻融20次，其间可对样品进行各种处理而不影响最终提取的RNA的质量。
6．结果准确，RNAwait进入细胞十分快速，基因表达在发生应急改变前就得以锁定，故RNA分析更能反映取样时的真实情况。
7．可比性强，RNAwait能减少大规模样品处理中的误差，增加各次实验数据间的可比性，对大规模基因表达谱的分析尤其有用。
8．兼容性广，处理过的样品可以使用TRIzol 等试剂提取其RNA，样品还可直接用于组织切片，免疫学和流式细胞分析而不影响RNA的质量。
‘陆’ 微生物检验标本采集和运送原则
采样时机
抗生素使用前(停用抗生素3至5天或下次用药前)采样
采样方法
采集无菌部位的标本应严格无菌操作，非无菌部位尽量减少正常菌群的污染，采样量足。
采样容器
专用的无菌，防渗漏，有盖，无酸、碱、防腐剂及消毒剂污染。
送检
尽快送检，一般不超过2小时。
若不能及时送检可于4-8℃保存，但对可疑淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌等对外界环境敏感的苛养菌感染的患者标本应室温保存。
当标本量小于1ml时应于15～30分钟内送检，防止挥发和干燥。
微生物检查的标本采集和运送原则
1.发现感染应及时采集微生物标本作病原学检查。
2.尽量在抗菌药物使用前，或停药3至5天后采集标本，如不能停用抗菌药物，应于下次抗菌药物应用前采集。应在感染的急性期或伤口局部治疗前采集标本。
3.选择正确的解剖部位，并以适当的技术、方法与容器收集足量的标本。
4.采样时应严格执行无菌操作，将污染可能降至最低。
5.收集真正感染的病灶处的标本，且避免邻近区域常居菌群的污染。
6.采用专用无菌容器收集标本。容器须灭菌处理，防止渗漏，但不得使用消毒剂。标本中不可添加防腐剂。
7.采样后应立即送检，最好在2h内。如不能及时送检，应将标本置于适当的储存环境待送，但不超过24小时。对可疑淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌等对外界环境敏感的苛养菌感染的患者标本应室温保存。当标本量小于1ml时应于15～30分钟内送检，防止挥发和干燥。
8.尽量不要以一般棉花拭子收集标本，应使用专用的纤维拭子。
9.每份标本都应贴上标签并标明必要信息，在检验申请单上填写足够的有关临床资料。(要标明病区、病人姓名、感染状况、近期抗菌药物使用情况、标本来源、检验目的、采集部位、采集及送检时间等)
10.同一天同一检测目的、相同标本(血液标本除外)一般只需送检一次(份)。涂片检查最好和细菌培养同时做!
拓展：
1.糖类的分解：细菌分泌胞外酶，将菌体外的多糖分解成单糖(葡萄糖)后再吸收。各种细菌将多糖分解为单糖，进而转化为丙酮酸，这一过程是一致的。丙酮酸的利用，需氧菌和厌氧菌则不相同。需氧菌将丙酮酸经三羧酸循环彻底分解成CO2和水。厌氧菌则发酵丙酮酸，产生各种酸类(如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、琥珀酸等)、醛类(如乙醛)、醇类(如乙醇、乙酸甲基甲醇、异丙醇、丁醇等)、酮类(如丙酮)。不同细菌具有不同的酶，对糖类的分解能力和代谢产物也不同，借此可以鉴别细菌。
2.蛋白质的分解：蛋白质分子在细菌分泌的蛋白质水解酶的作用下，在肽键处断裂，生成多肽和二肽。多肽和二肽在肽酶的作用下水解，生成各种氨基酸。二肽和氨基酸可被细菌吸收，氨基酸在体内脱氨基酶的作用下，经脱氨基作用生成氨。不同种细菌在不同的条件下所进行的脱氨基作用的方式(氧化脱氨基、水解脱氨基、还原脱氨基)及代谢产物也不同。可借此鉴别细菌。如有些细菌能使色氨酸氧化脱氨基，生成吲哚、C02和H20.细菌还可以用脱羧酶使氨基酸脱羧，生成胺类(如组胺)和C02.
3.细菌对其他物质的分解：细菌除能分解糖和蛋白质外，对一些有机物和无机物也可分解利用。各种细菌产生的.酶不同，其代谢的基质不同，代谢的产物也不一样，故可用于鉴别细菌。
(1)对其他有机物的分解：如变形杆菌具有尿素酶，可以水解尿素，产生氨。乙型副伤寒沙门菌和变形杆菌都具有脱硫氢基作用，使含硫氨基酸(胱氨酸)分解成氨和H2S.
(2)对其他无机物的分解：产气肠杆菌分解柠檬酸盐生成碳酸盐，并分解培养基中的铵盐生成氨。细菌还原硝酸盐为亚硝酸盐，氨和氮气的作用，称为硝酸盐还原作用。
4.细菌合成代谢产物的意义
(1)热原质：大多数为革兰阴性菌合成的菌体脂多糖。注入人体或动物体内能引起发热反应，故称热原质。
(2)毒素和侵袭性酶：细菌产生毒素，包括内毒素和外毒素。内毒素为草兰阴性菌的脂多糖。外毒素是革兰阳性菌产生的蛋白质，毒性强且有高度的选择性。有些细菌还能产生具有侵袭性的酶，如卵磷脂酶、透明质酸酶等。毒素和侵袭袭性酶在细菌致病性中甚为重要。
(3)色素：有水溶性色素(铜绿假单胞菌的色素)和脂溶性色素(金黄色葡萄球菌的色素)。不同细菌产生不同的色素，在鉴别细菌上有一定意义。
(4)抗生素：是由某些微生物代谢过程中产生的、能抑制或杀死另一些微生物和癌细胞的微量生物活性物质。
(5)细菌素：某些细菌菌株产生的一类具有抗菌作用的蛋白质，细菌素作用范围狭窄，仅对与产生该种细菌素的细菌有近缘关系的细菌才能起作用，如大肠菌素、绿脓菌素、变形菌素和弧菌素等。
‘柒’ 存放临床样本一定要独立的房间吗
存放临床样本一定要独立的房间。根据查询相关公开信息，存放临床样本对温度是有要求的，常在低温下保存，就要有单独的房间进行存放，确保样本不会损坏。